現代農學院楊建國課題組與合作者在構建穩(wěn)定通用高效固氮酶系統(tǒng)方面取得重要進展
將固氮酶系統(tǒng)導入農作物細胞以實現其自主固氮，從而減少甚至替代工業(yè)氮肥在農業(yè)生產中的應用是生物固氮研究的終極目標。2020年6月29日，北京大學現代農學院楊建國課題組與合作者在美國科學院院刊《PNAS》上以Article的形式在線發(fā)表了題為“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”的研究論文，研究揭示了固氮酶核心酶組分NifD蛋白在真核細胞器線粒體中的不穩(wěn)定性機制，同時進一步篩選到了在線粒體具有高穩(wěn)定性的NifD突變體，從而向構建真核適用的穩(wěn)定通用高效的固氮酶系統(tǒng)邁出了重要的一步，為實現農作物自主固氮的最終目標進一步打下堅實基礎。
工業(yè)氮肥的施用滿足了農作物的高產需求，同時也帶來了土壤板結、水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。當流失的硝酸鹽氮肥被轉化為二氧化氮時，還可致人予癌癥、心臟病，以及產生高于二氧化碳的溫室效應。因此，工業(yè)氮肥的大量施用嚴重阻礙了農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。相反，生物固氮是自然界中的部分原核微生物利用體內復雜的固氮酶系統(tǒng)，在常溫常壓下將大氣中的氮氣轉換為生物體可利用的氨的過程。如何利用生物固氮這種大自然提供的綠色氮肥以減少農業(yè)生產對工業(yè)氮肥的依賴，是擺在研究者面前的重要科學問題。通過生物工程方法，改造現有固氮系統(tǒng)，并最終將改造后的固氮系統(tǒng)直接導入到農作物的線粒體、葉綠體等靶細胞器，是實現農作物自主固氮，是實現農業(yè)生產中氮肥“綠色革命”的夢想。
合成生物學的發(fā)展為這一夢想的實現帶了新機遇，但是研究人員在利用合成生物學將固氮酶系統(tǒng)向真核系統(tǒng)轉移的過程中發(fā)現，來自棕色固氮菌和產酸克雷伯菌的固氮酶核心酶組分NifD蛋白無法在酵母及植物的線粒體中穩(wěn)定表達。因此，固氮酶系統(tǒng)核心酶組分在真核細胞器中的穩(wěn)定性成為了新的限制因素。為了解決這一問題楊建國課題組與合作者開展了一系列研究工作。首先，在NifD蛋白序列上確定了其在線粒體中涉及其穩(wěn)定性的相關區(qū)域，并通過進一步實驗在該區(qū)域內鎖定了一個關鍵氨基酸殘基：NifD-R98；其次，發(fā)現NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在序列上高度保守，當將四種具有代表性的固氮菌來源的NifD蛋白在酵母線粒體中分別表達時發(fā)現它們均高度不穩(wěn)定，因此推斷NifD-R98位導致的其在線粒體中的不穩(wěn)定性對于不同物種來源的NifD蛋白存在普遍性。接下來以大腸桿菌為底盤，分別重構了來源于酵母、水稻、煙草和擬南芥的功能性線粒體信號肽酶（mitochondrial-processing peptidase，MPP）的功能模塊；當這些MPP功能模塊分別與攜帶野生型NifD及其R98突變體的固氮酶系統(tǒng)進行共表達時，發(fā)現MPP直接參與了對固氮酶核心酶組分NifD蛋白的降解，而其相對應的R98突變體乃至其它固氮酶組分均可穩(wěn)定表達。由此可見，NifD蛋白在線粒體中的不穩(wěn)定性是由線粒體MPP酶的錯誤切割造成的；更重要的是，由于NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在結構上負責與固氮酶另一核心蛋白NifK的相互作用，暗示著突變該位點的極可能對固氮酶穩(wěn)定性產生重要影響。最終通過對該位點進行飽和突變及活性測定，找到了合適的NifD-R98位變體，它們既可保持較高的固氮酶活性，又能在酵母線粒體中穩(wěn)定表達（見配圖），這些NifD-R98位的突變體可用于未來在農作物細胞線粒體中構建具有完整功能性的固氮酶系統(tǒng)。此外，該研究首次以合成生物學手段在大腸桿菌中重構了四種定位于線粒體的蛋白穩(wěn)定性檢測系統(tǒng)，能夠對目的蛋白是否會被MPPs錯誤切割做出預評估，從而為線粒體定位的異源蛋白穩(wěn)定性測試提供了便捷工具。
配圖：固氮酶核心酶組分NifD蛋白及其穩(wěn)定突變體在酵母及植物線粒體中定位表達示意圖。野生型NifD（NifDwt）蛋白中由于存在一個天然的疑似內在線粒體信號肽酶（Mitochondrial-Processing Peptidase, MPP）切割位點，而被錯誤切割，從而導致其無法正確折疊；而NifD-R98P（NifDR98P）等突變體通過對NifD蛋白天然切割位點的突變限制了MPP酶的切割，從而保證了NifD蛋白的正確折疊。
北京大學現代農學院楊建國研究員與北京大學生命科學學院王憶平教授、英國John Innes Centre研究中心Ray Dixon教授為論文共同通訊作者。北京大學生命科學學院2017級博士研究生相楠為論文第一作者，2019級博士生郭琛月、2018級PTN項目博士生徐昊以及已畢業(yè)的劉繼偉博士參與了研究工作。該研究得到了科技部國家重點研發(fā)計劃“合成生物學”重點專項、國家自然科學基金重點項目、北京大學生科啟東創(chuàng)新基金、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室的資助。
原文鏈接：https://www.pnas.org/content/early/2020/06/24/2002307117
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