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作為一種生活中的常見致癌物，甲醛會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生很大的危害。但另一方面，生物體本身也產(chǎn)生一定量的甲醛。這些“內(nèi)源”甲醛分子是多條生理代謝途徑的原料或產(chǎn)物，與細(xì)胞的存活與生長密切相關(guān)。有研究顯示，作為一碳化合物，甲醛能夠被納入一碳循環(huán)（one-carbon-cycle），用于DNA與必需氨基酸的合成（Burgos-Barragan, G. et al. Nature, 2017, 548, 549–554）。雖然甲醛的這些生理功能逐漸被揭示，與甲醛相關(guān)的許多疑問仍有待探索。例如，細(xì)胞是通過何種機(jī)制來特異識(shí)別和感知內(nèi)源甲醛的濃度？甲醛對(duì)應(yīng)的信號(hào)是如何在細(xì)胞內(nèi)傳遞，產(chǎn)生響應(yīng)，并避免甲醛造成的損傷？我們又能否對(duì)細(xì)胞內(nèi)的甲醛動(dòng)態(tài)分布進(jìn)行精準(zhǔn)探測，以揭示甲醛的生理功能呢？

針對(duì)上述問題，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳鵬課題組著手對(duì)一個(gè)獨(dú)特的甲醛響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子HxlR進(jìn)行了深入研究，首次從結(jié)構(gòu)與化學(xué)機(jī)理上揭示了甲醛誘導(dǎo)HxlR蛋白發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)，所產(chǎn)生的“亞甲基橋”（methylene bridge）這一特殊化學(xué)修飾使HxlR產(chǎn)生功能獲得性（gain-of-function）生理響應(yīng)。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了首個(gè)可遺傳編碼的甲醛熒光探針（FAsor），成功應(yīng)用于檢測活細(xì)胞以及小鼠腦組織切片中甲醛的動(dòng)態(tài)變化。相關(guān)成果于2021年1月25日在線發(fā)表在《自然-通訊》雜志（Nature Communications），“Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction” （DOI：10.1038/s41467-020-20754-4）。

甲醛對(duì)于生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域的研究者來說并不陌生。如果思考這樣一個(gè)問題，甲醛與蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生什么化學(xué)反應(yīng)？答案可能是，甲醛能夠與蛋白質(zhì)上的親核性氨基酸側(cè)鏈發(fā)生加成反應(yīng)；甲醛作為蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑，能夠在蛋白質(zhì)的親核性殘基（如賴氨酸）之間形成交聯(lián)，使蛋白質(zhì)變性失活。然而，甲醛使蛋白質(zhì)變性的原因不能與細(xì)胞響應(yīng)甲醛的機(jī)制劃等號(hào)。首先，使蛋白質(zhì)變性的甲醛濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)源甲醛的濃度范圍；其次，甲醛使蛋白質(zhì)變性是一種非特異性的、損傷性的過程，這很難作為細(xì)胞精確響應(yīng)和調(diào)控生理水平甲醛的工作機(jī)制。因此，甲醛在細(xì)胞中有哪些特異性的響應(yīng)模式，這些響應(yīng)是通過什么樣的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，仍是一個(gè)未知的問題。在枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)的HxlR蛋白是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠在甲醛刺激下激活下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行功能獲得性（gain-of-function）的生理響應(yīng)（Yurimoto, H. et al. Mol. Microbiol., 2005, 57, 511–519）。受HxlR這一特性的吸引，研究團(tuán)隊(duì)選擇HxlR蛋白以探究其“特異”響應(yīng)甲醛分子的機(jī)制。

首先，為了確認(rèn)HxlR蛋白直接與甲醛發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合質(zhì)譜分析與X射線晶體學(xué)研究了HxlR與甲醛的相互作用。HxlR與甲醛共孵育后的質(zhì)譜分析顯示，甲醛能夠使HxlR發(fā)生+12 Da的分子量偏移。這一變化與甲醛誘導(dǎo)的亞甲基橋連一致，說明HxlR很有可能直接與甲醛發(fā)生了反應(yīng)。進(jìn)一步的二級(jí)質(zhì)譜肽段鑒定，以及HxlR-甲醛共晶結(jié)構(gòu)解析共同佐證了這一點(diǎn)。兩者的結(jié)果均顯示，與甲醛反應(yīng)之后，位于HxlR蛋白N端第一個(gè)α螺旋的半胱氨酸（Cys11）與賴氨酸（Lys13）殘基之間形成了位點(diǎn)特異的“亞甲基橋”。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)又通過位點(diǎn)突變來確認(rèn)該交聯(lián)反應(yīng)與HxlR蛋白功能的聯(lián)系。結(jié)果顯示，無論突變哪一個(gè)位點(diǎn)（C11A或K13A），HxlR都將失去響應(yīng)甲醛的能力。這說明HxlR蛋白的確通過Cys11和Lys13特異性識(shí)別甲醛，形成亞甲基橋這一獨(dú)特的化學(xué)修飾，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄功能的激活。

甲醛與HxlR蛋白位點(diǎn)特異性反應(yīng)形成分子內(nèi)“亞甲基橋”

那么甲醛誘導(dǎo)的分子內(nèi)交聯(lián)又是如何實(shí)現(xiàn)對(duì)HxlR蛋白功能的激活？研究團(tuán)隊(duì)接下來仔細(xì)分析了不同處理?xiàng)l件與突變體的HxlR蛋白晶體結(jié)構(gòu)。通過對(duì)甲醛處理前后的HxlR結(jié)構(gòu)對(duì)比，他們發(fā)現(xiàn)看似簡單的亞甲基橋卻引起了蛋白整體構(gòu)象的極大變化！甲醛誘導(dǎo)的Cys11-Lys13亞甲基橋迫使原本位于同一α螺旋兩側(cè)的兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈相互靠近，扭曲了α螺旋結(jié)構(gòu)，并“牽一發(fā)而動(dòng)全身”，帶動(dòng)HxlR蛋白N端主鏈朝向翻轉(zhuǎn)（N-terminal flipping），使得蛋白整體構(gòu)象發(fā)生改變，極大地增強(qiáng)HxlR蛋白與DNA的結(jié)合能力，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。至此，研究團(tuán)隊(duì)揭示了HxlR特異性響應(yīng)甲醛并發(fā)生結(jié)構(gòu)與功能轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制。

甲醛通過位點(diǎn)特異的亞甲基橋連激活轉(zhuǎn)錄因子HxlR

這一甲醛響應(yīng)機(jī)制的解析進(jìn)一步為研究團(tuán)隊(duì)提供了啟示：HxlR特異性響應(yīng)甲醛的構(gòu)象變化可以用于設(shè)計(jì)甲醛檢測的熒光探針。目前已報(bào)道的甲醛探針均為小分子探針，時(shí)空分辨率與細(xì)胞、組織特異性受到限制，難以對(duì)甲醛的細(xì)胞內(nèi)分布進(jìn)行精確檢測。基因編碼的熒光探針，在時(shí)空分辨的檢測、動(dòng)態(tài)檢測等方面都更有優(yōu)勢，但鑒于甲醛響應(yīng)機(jī)制研究的缺乏，難以設(shè)計(jì)基于蛋白質(zhì)的探針。而HxlR蛋白相應(yīng)甲醛的分子機(jī)制的解析無疑為這一問題提供了解決方案。

基于對(duì)HxlR蛋白的結(jié)構(gòu)分析，研究團(tuán)隊(duì)向HxlR特定位點(diǎn)嵌入了對(duì)結(jié)構(gòu)變化敏感的熒光蛋白，并通過篩選和優(yōu)化，成功開發(fā)出一系列新型基因編碼的甲醛熒光探針。他們首先在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)探針進(jìn)行了表征。之后，研究團(tuán)隊(duì)利用該探針，成功進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)甲醛濃度的動(dòng)態(tài)檢測；通過多色熒光成像，對(duì)不同亞細(xì)胞空間下甲醛變化進(jìn)行了同步檢測；通過干擾甲醛代謝通路，記錄了探針對(duì)胞內(nèi)甲醛生理濃度變化的響應(yīng)。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)李毓龍課題組合作，檢測了該探針在小鼠腦組織切片中對(duì)甲醛的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，驗(yàn)證了該探針具有動(dòng)物組織水平的應(yīng)用潛力。

基于甲醛響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子HxlR蛋白的新型甲醛探針

?綜上，該工作實(shí)現(xiàn)了對(duì)“甲醛響應(yīng)”蛋白HxlR的機(jī)制解析，發(fā)現(xiàn)了甲醛誘導(dǎo)HxlR產(chǎn)生獨(dú)特化學(xué)修飾，并由該亞甲基橋引起構(gòu)象變化和激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。受此啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了首個(gè)遺傳編碼的甲醛探針，為研究細(xì)胞內(nèi)源甲醛的調(diào)控與功能提供了重要工具。

需要指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)的“分子內(nèi)交聯(lián)”這一獨(dú)特的化學(xué)修飾，可能與蛋白?；?、烷基化等翻譯后修飾類似，能夠調(diào)控蛋白質(zhì)的活性與功能。例如近期有研究顯示，糖酵解通路的中間產(chǎn)物丙酮醛，可以對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激通路蛋白KEAP1進(jìn)行“分子內(nèi)交聯(lián)”修飾，在鄰近的精氨酸（Arg）與半胱氨酸（Cys）之間產(chǎn)生交聯(lián)，啟動(dòng)下游應(yīng)激響應(yīng)（Bollong, M. et al. Nature, 2018, 562, 600–604）。可以預(yù)見,“分子內(nèi)交聯(lián)”修飾的種類、性質(zhì)與功能，值得進(jìn)一步探索。

?陳鵬課題組2012級(jí)博士畢業(yè)生祝融峰、張功為共同第一作者；北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、生命科學(xué)聯(lián)合中心李毓龍教授及其課題組2012級(jí)博士畢業(yè)生井淼完成了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵數(shù)據(jù)。該工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、北京分子科學(xué)國家研究中心以及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-20754-4

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