生命學院姚駿課題組發(fā)現突觸囊泡停泊初始態(tài)發(fā)生的過程及其分子機制
神經元之間的信號傳遞是大腦最基礎的生理活動，當動作電位到達突觸時，突觸小泡在毫秒級的時間內釋放神經遞質，從而使動作電位快速跨突觸傳遞，這一過程受到特定蛋白質機器的精密調控。突觸小泡與質膜的融合可分為停泊（Docking）、點火（Priming）和融合（Fusion）三個過程。停泊作為囊泡融合的起始階段，其重要意義在于大腦的神經活動并不是以單個的動作電位發(fā)生的，而是以十分高頻率的一串動作電位的方式進行，這就要求突觸有一批能快速釋放的囊泡在時刻準備著。囊泡的即刻可釋放池（RRP）保障了這一功能，并作為決定突觸強度的首要因素，影響著神經元和大腦許多重要的功能，而停泊這一過程是囊泡進入即刻可釋放池的初始步驟，其如何發(fā)生、由誰介導，目前尚無定論。
在文獻報道中，Synaptotagmin-1 (Syt1)和三個SNARE蛋白形成的復合物，是介導突觸小泡停泊的潛在候選分子機器。SNARE 復合物由三個蛋白組成，是囊泡與質膜融合的最小蛋白機器。Syt1則是動作電位誘發(fā)突觸小泡釋放的鈣離子感受器。在經典的囊泡融合模型中，三個SNARE蛋白在遠端結合形成一個Z字型的拉鏈，隨著4個平行α螺旋束結構的形成，囊泡自遠而近地完成了停泊-點火（Docking-Priming）的過程，進入準備釋放（release ready）的狀態(tài)，這是囊泡停泊的傳統(tǒng)模型，即SNARE complex介導了囊泡的停泊。然而，這一模型存在較大爭議，原因在于兩方面。一方面，停泊的形態(tài)學定義（即囊泡須緊貼于質膜）并不準確，停泊究竟在什么位置啟動，一直是懸而未決的問題。另一方面，在蛋白機器研究上，多重基因敲除動物模型不但耗時耗力，而且存在很多發(fā)育缺陷與代償作用帶來的負面效應。
為解決上述技術障礙，姚駿課題組開發(fā)了在體高效沉默多重基因的CRISPRi技術，在神經元中，高效特異地對基因單獨或者聯(lián)合進行條件性敲低，在神經元內構建出類體外重構的環(huán)境。另外，課題組結合高壓冷凍（High pressure freezing）與電子斷層掃描（TEM tomography）技術，得到接近真實狀態(tài)下神經元突觸不同基因敲除的三維電鏡數據。從而對突觸小泡的停泊過程進行精確的電鏡觀測和定義。作者首先對SNARE復合物進行了多重敲低，發(fā)現在離突觸前膜2-12 nm的范圍內，突觸小泡出現了數倍于對照組的聚集。在SNARE 全敲的基礎上引入Syt1敲低后，突觸小泡的聚集現象消失，這說明Syt1可能是將囊泡圈定在2-12 nm范圍內的關鍵因素。隨后的一系列實驗全面證實了Syt1的這一功能。進一步，作者們開始探索Syt1 啟動突觸囊泡停泊的分子伴侶。脂質體共沉淀實驗（co-sedimentation）表明，Syt1 可以通過其C2B domain 上的K325-K327模塊與PIP2結合，突變這一模塊（Syt1KA），Syt1則無法與PIP2相互作用。而Syt1與SNARE結合有兩個界面，同時突變這些界面位點（Syt1Q/LLQQ），可以有效地減弱Syt1與SNARE的結合。作者發(fā)現，在Syt1/SNARE敲低組中引入Syt1KA突變體，并不能讓突觸小泡被圈定在2-12 nm 范圍內，而Syt1Q/LLQQ卻可以執(zhí)行這一功能。所以，Syt1很可能通過與PIP2結合來啟動突觸小泡停泊。針對PIP2的功能研究，作者們使用了四種不同的方法來降低或提升突觸前膜上PIP2的含量，包括PIP2合成酶PIP5K三個亞型的三重敲降、PIP2水解酶Synaptojanin-1 (Synj)的增強型突變，以及代謝型谷氨酸受體mGluN5的拮抗劑和激動劑處理。這四種方法均有效地改變了突觸前膜上PIP2的含量。此外，電鏡分析結果表明，降低PIP2含量可抑制Syt1在2-12 nm處啟動突觸小泡的停泊，而提升PIP2含量則無明顯效應。這一系列實驗，證明了PIP2是Syt1在膜上的分子伴侶，它們相互作用、共同啟動了突觸小泡的Docking。
綜合來看，本項研究發(fā)現Syt1結合PIP2介導了突觸小泡的停泊的起始過程，其作用位置位于距質膜約12 nm處, 該過程不依賴于SNARE 復合物，且優(yōu)先于SNARE 復合物的形成。通過這一研究，作者們發(fā)現了Docking起始態(tài)發(fā)生的位置和分子機制，為理解神經遞質的釋放過程，尤其是理解大腦在受到高頻生理刺激時神經元保持快速高效的響應，做出了重要貢獻。
圖一 突觸囊泡Docking的動態(tài)過程及其分子機制
此研究工作于2021年3月16日在線發(fā)表于Cell Reports雜志。清華大學生命學院姚駿研究員為本文的通訊作者。生命學院博士生陳運、王穎菡及生命學院已出站博士后鄭毅為共同第一作者。清華大學生命學院李雪明研究員及其實驗室李美靜博士，姚駿課題組王秋文博士、博士生汪兵、付崇雷、劉要南為本項研究工作做出了重要貢獻。清華大學冷凍電鏡平臺李英博士和胡曉風、細胞影像平臺王文娟博士、NIBS何萬中研究員和尼康公司李勛博士為本研究提供了重要幫助。
全文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00156-X
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