生命學(xué)院陳國(guó)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)利用溫控動(dòng)態(tài)調(diào)控開(kāi)關(guān)在大腸桿菌實(shí)現(xiàn)聚羥基脂肪酸酯的精確組裝
合成生物學(xué)通過(guò)構(gòu)建各類(lèi)動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)控制精確調(diào)控代謝通路，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)和特定的細(xì)胞行為。然而在代謝工程領(lǐng)域，由于實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因線(xiàn)路往往缺少魯棒性，要想在大體積的發(fā)酵體系中實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的中后期的動(dòng)態(tài)調(diào)控依然有很大的挑戰(zhàn)。簡(jiǎn)單的化學(xué)誘導(dǎo)開(kāi)關(guān)由于誘導(dǎo)物的高成本、不可移除性已經(jīng)不能滿(mǎn)足生物生產(chǎn)的需求；光誘導(dǎo)系統(tǒng)在高細(xì)菌密度時(shí)難以穿透發(fā)酵罐進(jìn)行精確調(diào)控；實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的復(fù)雜的、多元件的開(kāi)關(guān)在大尺度的發(fā)酵體系往往會(huì)失效。與其他感應(yīng)系統(tǒng)相比，溫度開(kāi)關(guān)有低成本、快速響應(yīng)、可移除等優(yōu)勢(shì)。工業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)有成熟的熱質(zhì)傳遞理論，因此在發(fā)酵罐體系能夠比較容易進(jìn)行溫度調(diào)控?？傮w而言，溫控開(kāi)關(guān)有應(yīng)用于大規(guī)模發(fā)酵的潛力。
生命學(xué)院陳國(guó)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)于2021年3月3日在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“在大腸桿菌中利用可逆溫度調(diào)控開(kāi)關(guān)實(shí)現(xiàn)雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控”（Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli）的文章https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x ，論文利用由溫度控制的雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控開(kāi)關(guān)，在7-L發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)了生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中后期的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了聚羥基脂肪酸酯（PHA）的精確組裝，證明了溫控開(kāi)關(guān)用于大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。在不同尺度實(shí)現(xiàn)組織調(diào)控：納米級(jí)的生物高分子聚合物合成，微米級(jí)的單細(xì)菌形態(tài)控制，毫米級(jí)的細(xì)菌菌落“類(lèi)樹(shù)木年輪”菌落，證明了構(gòu)建的溫控開(kāi)關(guān)具有普遍適用性和系統(tǒng)穩(wěn)定性（圖1）。
圖1. 利用溫控開(kāi)關(guān)T-switch實(shí)現(xiàn)生物圖案、細(xì)菌變形及高分子組裝
論文首先基于溫度敏感的轉(zhuǎn)錄因子CI857和TetR家族的轉(zhuǎn)錄抑制子PhlF構(gòu)建出溫度敏感的基因開(kāi)關(guān)T-switch。在30℃和37℃時(shí)，編碼綠色熒光蛋白的基因sfgfp和編碼紅色熒光蛋白的基因mrfp分別轉(zhuǎn)錄表達(dá)，經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化和表征，雙向動(dòng)態(tài)溫度調(diào)控開(kāi)關(guān)T-switch可以在溫度在30℃和37℃之間實(shí)現(xiàn)不同基因的同時(shí)轉(zhuǎn)錄上調(diào)和下調(diào)。
隨后T-switch被應(yīng)用于三個(gè)不同的場(chǎng)景。第一個(gè)場(chǎng)景是受溫度的季節(jié)性變化觸發(fā)的樹(shù)木年輪的啟發(fā)，通過(guò)模仿“年輪”圖案的形成過(guò)程，在平板上生成類(lèi)年輪的細(xì)菌菌環(huán)，創(chuàng)造出新的不依賴(lài)于濃度信號(hào)差生成的圖案（pattern），實(shí)現(xiàn)了毫米級(jí)的圖案控制（圖2）。通過(guò)對(duì)生物圖案形成的探究與創(chuàng)造，可以為研究者審視生物發(fā)育、生長(zhǎng)、形成圖案提供新的思路。
圖2. 類(lèi)樹(shù)木年輪的細(xì)菌菌落形成
第二個(gè)場(chǎng)景是細(xì)菌形態(tài)的變化，論文使用T-switch控制mreB和ftsZ基因，通過(guò)改變溫度實(shí)現(xiàn)細(xì)菌從球形、桿狀到纖維狀動(dòng)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞微米級(jí)的形態(tài)控制（圖3）。細(xì)菌產(chǎn)物有一大類(lèi)是在胞內(nèi)以“內(nèi)涵體”形式存在的產(chǎn)物，包括PHA、糖原、聚氨基酸等。細(xì)胞體積大小決定了這些產(chǎn)物生產(chǎn)的上限，而細(xì)菌往往只有0.5-2μm大小，因此通過(guò)改變細(xì)菌的形狀能夠有效地改變“內(nèi)涵體”產(chǎn)物的積累，越大越長(zhǎng)的細(xì)菌能夠使得胞內(nèi)產(chǎn)物積累更多。另外通過(guò)對(duì)細(xì)菌形態(tài)的調(diào)節(jié)，使得細(xì)菌體積增大、細(xì)菌長(zhǎng)度變長(zhǎng)，提高了細(xì)菌與發(fā)酵液自動(dòng)分離的能力，使得下游收集菌體過(guò)程更方便，能耗成本更低。
圖3. 溫度控制細(xì)菌形態(tài)的變化
第三個(gè)場(chǎng)景是細(xì)胞內(nèi)高分子的精確組裝。聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHAs）是一類(lèi)主要由微生物合成，生物可降解且具有生物相容性的高分子材料，將有很大的潛力解決全球塑料污染問(wèn)題。目前已經(jīng)商業(yè)化的PHA例如PHBV，P3HB4HB以及PHBHHx，都是隨機(jī)共聚物。而嵌段聚合物在隨機(jī)聚合物的基礎(chǔ)上不僅可以改善材料性能，還可以解決材料老化等問(wèn)題【4】，但是由于PHA生產(chǎn)的相關(guān)碳源（前體）價(jià)格昂貴，不用葡萄糖等非相關(guān)碳源進(jìn)行生產(chǎn)，是很難實(shí)現(xiàn)嵌段PHA的工業(yè)化，因此，通過(guò)使用具有成本效益的碳源來(lái)設(shè)計(jì)無(wú)誘導(dǎo)劑的PHA嵌段共聚物生產(chǎn)開(kāi)關(guān)非常有必要。論文通過(guò)T-switch在大腸桿菌中控制3-羥基丁酸（3HB）和4-羥基丁酸（4HB）出現(xiàn)的時(shí)序，成功在7L發(fā)酵罐生成了4HB比例從30到89mol%的隨機(jī)共聚物P（HB-co-4HB）和4HB比例從10到60mol%的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB，隨著4HB單體比例的變化，隨機(jī)共聚物P（HB-co-4HB）的熔融溫度從無(wú)到有、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低、楊氏模量和拉伸應(yīng)力增強(qiáng)、斷裂延伸率保持在800%以上。和隨機(jī)共聚物相比，相同4HB比例的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB有PHB和P4HB的特征熔融溫度峰、楊氏模量和拉伸應(yīng)力顯著高于隨機(jī)共聚物，體現(xiàn)了更加優(yōu)良的材料性能。上述實(shí)驗(yàn)在大尺寸的發(fā)酵罐復(fù)雜體系統(tǒng)完成了納米級(jí)的聚合物的精確合成控制，證明了該系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
綜上所述，本研究構(gòu)建出一個(gè)溫度控制可多次調(diào)控的雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)了菌落圖案、細(xì)菌形態(tài)控制和PHA精確組裝，并且能夠在7-L發(fā)酵罐中細(xì)菌高密度發(fā)酵時(shí)實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控。
清華大學(xué)生命學(xué)院、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中學(xué)博士生王宣及清華大學(xué)學(xué)堂班本科生韓佳寧（現(xiàn)康奈爾大學(xué)博士生）為論文的共同第一作者，清華大學(xué)生命學(xué)院陳國(guó)強(qiáng)教授及中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所葉健文為論文的共同通訊作者，生命學(xué)院博士生張旭、馬悅原、林藝娜、王歡，北京大學(xué)物理學(xué)院碩士生李典杰，生命學(xué)院本科生鄭陶然以及生命學(xué)院吳赴清副研究員參與該研究。該研究得到了科技部重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金委、清華-INDITEX持續(xù)發(fā)展基金的資助。
Wang, X., Han, JN., Zhang, X. et al. Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nat Commun 12, 1411 (2021). ?https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x
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