生命學(xué)院方顯楊課題組報道長鏈RNA位點特異性共價標(biāo)記金納米顆粒的新技術(shù)及其應(yīng)用
2020年8月31日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院方顯楊課題組在《美國科學(xué)院院報》（PNAS）發(fā)表了題為“基于拓寬遺傳密碼轉(zhuǎn)錄的長鏈RNA位點特異性共價標(biāo)記納米顆粒技術(shù)”（Site-specific covalent labeling of large RNAs with nanoparticles empowered by expanded genetic alphabet transcription）的文章。
RNA的結(jié)構(gòu)-功能研究是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的前沿?zé)狳c和難點。由于RNA自身的柔性和分子量限制，應(yīng)用傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，例如X射線晶體學(xué)、核磁共振或冷凍電鏡對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究非常困難。當(dāng)前，RNA的三維空間結(jié)構(gòu)信息還非常少。為研究RNA的結(jié)構(gòu)，可通過向RNA分子中位點特異性的引入一些探針或活性標(biāo)記物（例如，金納米顆粒， 順磁探針， 熒光探針等），引入新的研究手段（例如，X射線散射干涉，電子順磁共振，單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移等），發(fā)展RNA的整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方案。
X射線散射干涉（X-ray scattering interferometry, XSI）是基于小角X射線散射技術(shù)（SAXS）的一種新的分子標(biāo)尺（molecular ruler）。通過向生物大分子位點特異性的標(biāo)記上單個或成對的金納米顆粒，通過SAXS實驗，可提供20-400埃范圍內(nèi)的位點特異性距離信息，因而在生物大分子的結(jié)構(gòu)與動態(tài)特性研究中具有極大潛力。目前蛋白質(zhì)和DNA的位點特異性標(biāo)記技術(shù)已有多種方案，而RNA，特別是長鏈RNA的位點特異性標(biāo)記十分具有挑戰(zhàn)性。當(dāng)前， RNA的位點特異性標(biāo)記主要是通過固相化學(xué)合成實現(xiàn)的，這一方案通常對長度小于100個核苷酸的RNA適用，因而，當(dāng)前XSI的應(yīng)用主要局限在短鏈RNA。
為突破位點特異性標(biāo)記RNA分子量限制的瓶頸，推廣XSI在長鏈RNA結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用，發(fā)展RNA整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)方案，該文利用包含NaM-TPT3非天然堿基核苷酸對的拓展遺傳密碼體系，通過化學(xué)合成堿基帶有氨基修飾的TPT3（rTPT3A）（圖1A），經(jīng)過PCR和體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在RNA中位點特異性的引入TPT3A，進(jìn)一步利用NHS-氨基化學(xué)反應(yīng)的高選擇性，通過與氨?；揎椀慕鸺{米顆粒反應(yīng)，建立了長鏈RNA位點特異性金納米顆粒標(biāo)記的策略（圖1B）。
圖1. 基于拓展遺傳密碼體系的長鏈RNA位點特異性金納米顆粒標(biāo)記技術(shù)及其在X射線散射干涉中的應(yīng)用。
登革病毒是重要的病原體，通過蚊蟲叮咬在人類和其他動物中傳播，對公共衛(wèi)生健康產(chǎn)生極大威脅。登革熱病毒是單股正鏈RNA病毒，其基因組RNA的線性-環(huán)化構(gòu)象轉(zhuǎn)換病毒的復(fù)制和致病性具有重要作用，對其機(jī)理進(jìn)行研究有著重要意義。該文選擇登革病毒的位于基因組RNA3’非翻譯區(qū)長度為97個核苷酸的3’SL元件和長度為719個核苷酸DENV-Mini RNA元件，分別代表線性化和環(huán)化基因組RNA，應(yīng)用上述標(biāo)記策略，成功實現(xiàn)了位點特異性的金納米顆粒的標(biāo)記， 并應(yīng)用XSI測定了相關(guān)距離 （圖1C）。XSI結(jié)果為領(lǐng)域內(nèi)之前基于RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測提出的線性-環(huán)化構(gòu)象變化模型提供了重要的實驗數(shù)據(jù)的支持。
清華大學(xué)生命學(xué)院方顯楊研究員為本文的通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2016級PTN博士生王巖為本文的第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2014級本科生陳垚宜（現(xiàn)在德國Freie Universität攻讀博士學(xué)位）在項目的先期探索中做出了重要貢獻(xiàn)，2017級CLS博士生胡艷萍參與了部分工作。該項目受國家自然科學(xué)基金委大科學(xué)裝置科學(xué)研究聯(lián)合基金重點支持項目、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。美國阿貢國家實驗室先進(jìn)光源12-ID-B線站為小角X射線散射數(shù)據(jù)的收集提供了支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117
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