生命學院陳春來課題組合作揭示糖基化酶AlkD找尋和識別靶標的機制
2020年8月20日，清華大學生命科學院陳春來課題組、香港科技大學黃旭輝課題組、北京大學趙新生課題組和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員合作在《美國科學院院報》（PNAS）雜志發(fā)表了題為“利用掃描FRET-FCS和馬爾可夫態(tài)模型揭示糖基化酶AlkD找尋和識別靶標的機制”（Target search and recognition mechanisms of glycosylase AlkD revealed by scanning FRET-FCS and Markov State Models）的文章。
DNA結(jié)合蛋白識別DNA上特異性位點是基因復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、表達調(diào)控和CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫等重要生理生化過程的基礎(chǔ)。然而DNA結(jié)合蛋白如何在包含幾百萬甚至幾十億個堿基對的基因組中高效并準確的識別其特異性結(jié)合位點，仍然是個未解之謎。DNA糖基化酶是一類極其重要的DNA結(jié)合蛋白，作為DNA修復(fù)酶，它的功能是識別基因組上的DNA損傷位點并介導(dǎo)相應(yīng)的修復(fù)過程，在維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的功能。捕捉DNA糖基化酶在搜尋靶標過程中的動力學信息，對于闡明糖基化酶介導(dǎo)的DNA修復(fù)過程的分子機制和生理功能都是必不可少的。
人們推測糖基化酶在DNA上一維擴散時存在著“高速低準確度”和“低速高準確度”兩種靶標搜尋模式，其通過在兩種搜尋模式之間切換實現(xiàn)找尋靶標的高效和高準確度。迄今為止，人們并不了解糖基化酶等只存在單一結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白是如何實現(xiàn)在“高速低準確度”和“低速高準確度”搜尋模式之間切換的。究其原因是由于目前測量技術(shù)的空間分辨率和時間分辨率有限，研究者僅能直接捕捉到糖基化酶等單結(jié)構(gòu)域蛋白在DNA上的高速搜尋模式，而低速搜尋模式以及DNA結(jié)合蛋白在兩種搜尋模式之間的切換過程則沒有直接的實驗證據(jù)。
針對以上技術(shù)問題，本文發(fā)展了新型高時間分辨率（亞微秒）和高空間分辨率（亞納米）的掃描熒光共振能量轉(zhuǎn)移相關(guān)光譜技術(shù)（scanning FRET-FCS）。利用這一新技術(shù)，他們不但捕捉到糖基化酶AlkD在雙鏈DNA（dsDNA）上的快速一維擴散模式，還首次捕捉到了AlkD一維擴散的慢搜尋模式（圖1）。從中定量得到快速搜尋過程的擴散系數(shù)是8´106 bp2 s-1，這與前人的測量值是相吻合的；而慢速搜尋過程的擴散系數(shù)是6´104 bp2 s-1。在此基礎(chǔ)上，他們利用大規(guī)模的全原子分子動力學模擬結(jié)合馬爾可夫態(tài)模型，進一步揭示了慢搜尋模式的工作機制，發(fā)現(xiàn)AlkD在沿著dsDNA螺旋結(jié)構(gòu)移動一個堿基對的過程中，平動過程和轉(zhuǎn)動過程是依次進行的。AlkD相對dsDNA的轉(zhuǎn)動較慢，是一維擴散的決速步。利用動力學模型得到的擴散時間尺度與實驗測量值很好地吻合，佐證了計算模型的準確性。他們還結(jié)合實驗測量和動力學模擬，在原子相互作用層面仔細探究了Y27位殘基對一維擴散過程的影響機制。
圖1：融合單分子scanning FRET-FCS測量與分子動力學模擬闡釋AlkD在dsDNA上的擴散動力學過程和分子機制。
文章最后提出了如圖2所示的模型：在未修飾的正常堿基區(qū)域，AlkD與dsDNA相互作用較弱，此時主要利用快速模式實現(xiàn)高效快速的搜尋；而修飾堿基會導(dǎo)致附近dsDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變化，從而誘導(dǎo)AlkD-dsDNA結(jié)合構(gòu)象的變化和相互作用力的加強，促使AlkD從快速轉(zhuǎn)變?yōu)槁偎褜つＪ?，實現(xiàn)對修飾堿基的準確識別。在此模型中，AlkD通過改變與dsDNA的相互作用構(gòu)象和結(jié)合強弱，實現(xiàn)在快慢兩種搜尋模式中的切換和調(diào)控，從而獲得靶標搜尋中的高效和高準確度。本文發(fā)展了緊密融合單分子掃描熒光共振能量轉(zhuǎn)移-相關(guān)光譜（scanning FRET-FCS）測量與馬爾可夫態(tài)模型的新型技術(shù)平臺，突破單一技術(shù)手段的局限，為揭示糖基化酶和其它DNA結(jié)合蛋白搜尋靶標的動態(tài)過程和分子機制提供了新的技術(shù)平臺。
圖2：AlkD找尋和識別靶標的分子機制。
清華大學生命科學學院陳春來研究員、香港科技大學黃旭輝教授、北京大學趙新生教授和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員為本文共同通訊作者。清華大學生命學院15級博士生彭思佳、香港科技大學博士生王曉維和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員為共同第一作者。北京大學博士生何姍珊參與了FRET-FCS實驗。本工作獲得了國家自然科學基金委、北京結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學聯(lián)合中心及中國香港研究資助局的經(jīng)費支持。
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https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
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