熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

用于FRET試驗(yàn)的染料是可以相同的。但在大多數(shù)應(yīng)用中其實(shí)是使用不同的染料。簡(jiǎn)單地說，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量從供體(染料1)向受體(染料2)轉(zhuǎn)移的過程。通常，供體 （Donor）熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜要與受體（Acceptor）基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊。當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)（10 – 100 Å)），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。能量轉(zhuǎn)移發(fā)生方式依賴于受體的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

• a) 被轉(zhuǎn)化為分子的振動(dòng)，即發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅。(受體是猝光劑)
• b) 發(fā)射更強(qiáng)于受體本身的特征熒光，造成次級(jí)熒光光譜的紅移。 (受體是熒光發(fā)射體)。

一個(gè)供體基團(tuán)（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當(dāng)該底物未被切斷時(shí)，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測(cè)不到熒光。當(dāng)該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測(cè)到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過程可被連續(xù)監(jiān)測(cè)，為酶活性的檢測(cè)提供了一個(gè)便捷的方法。供體/受體對(duì)的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級(jí)濃度的酶活性。當(dāng)FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當(dāng)供體/受體對(duì)的任何肽鍵斷裂就會(huì)釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測(cè)，從而可對(duì)酶的活性進(jìn)行定量分析。

FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：

1. 肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動(dòng)力特征和功能特征。
2. 對(duì)新的蛋白水解酶的篩選和檢測(cè)。
3. 對(duì)多肽折疊的構(gòu)象研究。

以下是一些用于FRET的標(biāo)準(zhǔn)染料組合::

1. Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
2. Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
3. Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
4. Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
5. Dabcyl and Glu(EDANS)

在蛋白酶的多肽底物內(nèi)經(jīng)共振能量轉(zhuǎn)移引發(fā)熒光猝滅的供體-接受對(duì)

常規(guī)RET供體-接受對(duì)的福斯特臨界距離（Forster Critical Distance）

(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene