熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物,受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí),可激發(fā)成為激發(fā)態(tài),當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí),發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上,利用它的熒光特性來提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無放射物污染,操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。
熒光標(biāo)記物質(zhì)在蛋白的功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性,并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)(例如,各種激酶、磷酸酶、肽酶等)。因此,多肽的熒光修飾,同樣是多肽合成領(lǐng)域的重要內(nèi)容。
下面是一些常用的多肽修飾熒光物質(zhì):
下面是一些熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長
熒光基團(tuán) |
Ex(nm) |
Em(nm) |
熒光基團(tuán) |
Ex(nm) |
Em(nm) |
羥基香豆素 |
325 |
386 |
R-phycoerythrin (PE) (489) |
565 |
578 |
丹磺酰氯 |
340 |
578 |
Rhodamine Red-X |
560 |
580 |
AMC |
345 |
445 |
Tamara |
565 |
580 |
甲氧基香豆素 |
360 |
410 |
Alexa fluor 555 |
556 |
573 |
Alexa fluor 系列 |
345 |
442 |
Alexa fluor 546 |
556 |
573 |
氨基香豆素 |
350 |
445 |
Rox |
575 |
602 |
Dabcyl |
453 |
- |
Alexa fluor 568 |
578 |
603 |
Cy2 |
490 |
510 |
Texas Red |
589 |
615 |
FAM |
495 |
517 |
Alexa fluor 594 |
590 |
617 |
Alexa fluor 488 |
494 |
517 |
Alexa fluor |
621 |
639 |
FITC |
495 |
519 |
Alexa fluor 633 |
650 |
668 |
Alexa fluor 430 |
430 |
545 |
Cy5 (625) |
650 |
670 |
5-FAM |
492 |
518 |
Alexa fluor 660 |
663 |
690 |
Alexa fluor 532 |
530 |
555 |
Cy5.5 |
675 |
694 |
HEX |
535 |
556 |
TruRed |
490; 675 |
695 |
5-TAMRA |
542 |
568 |
Alexa fluor 680 |
679 |
702 |
Cy3 |
550 |
570 |
Cy7 |
743 |
767 |
TRITC |
547 |
572 |
Cy3.5 |
581 |
596 |
1. FITC修飾
異硫氰酸熒光素(FITC)具有比較高的活性,通常來說,在固相合成過程中引入該種熒光基團(tuán)相對(duì)于其他熒光素要更容易,并且反應(yīng)過程中不需要加入活化試劑。
我們公司合成的FITC修飾的多肽通常主要有兩種形式:
(1)在整條肽鏈末端接入FITC,并且在FITC之前接入一分子的Acp(6-氨基己酸),也稱烷基間隔器。反應(yīng)中FITC與肽鏈上裸露的-NH2反應(yīng),Acp的接入提供了六個(gè)碳的直鏈空間,大大降低了反應(yīng)的空間位阻,提高了反應(yīng)效率,降低了反應(yīng)難度。其次,F(xiàn)ITC還與多肽結(jié)構(gòu)中的-SH,側(cè)鏈-NH2反應(yīng),Acp的加入也降低了這種副反應(yīng)發(fā)生的可能。此外,多肽在酸性環(huán)境條件下切割時(shí),在N端接入FITC的多肽需要經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素,這種過程通常都會(huì)伴隨最后一個(gè)氨基酸的切除,而烷基間隔器Acp的接入就避免了這一情況的發(fā)生。
(2)在整條肽中的某個(gè)Lys側(cè)鏈接入FITC,Lys側(cè)鏈為末端為-NH2的四碳直鏈烷基,直接起到了降低空間位阻的作用。這種修飾方式能夠靈活的在整條肽中任何位置進(jìn)行FITC修飾,而不僅僅局限于末端。
我們所采用的FITC修飾多肽的兩種形式,都具有操作簡(jiǎn)便,成功率高,容易分離純化等優(yōu)點(diǎn)。
2. AMC修飾
7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑,例如,酶的痕量測(cè)定,酶的鑒定,激光染料的制備等多種用途,此外,C端用香豆素修飾的泛素分子也是研究蛋白質(zhì)泛素化過程的重要探針。
與其他熒光染料不同的是,AMC修飾多肽分子是從C端進(jìn)行:(1)AMC與肽鏈C端第一個(gè)氨基酸反應(yīng); (2)固相合成整條肽鏈(從第二個(gè)氨基酸開始),并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護(hù)基和最后一個(gè)氨基保護(hù)基;(3)液相縮合AA-AMC與全保護(hù)的肽鏈;(4)切除保護(hù)基,完成肽鏈的修飾。
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