陳春來課題組揭示CRISPR-Cas12a蛋白復(fù)合體切割雙鏈DNA的動態(tài)調(diào)控機制
2019年8月6日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來研究組在Cell期刊新推出的子刊《iScience》上發(fā)表了題為“crRNA和DNA的匹配度對Cas12a蛋白復(fù)合體切割雙鏈DNA的動態(tài)結(jié)構(gòu)和切割位點的調(diào)控”（Conformational dynamics and cleavage sites of Cas12a are modulated by complementarity between crRNA and DNA）的研究論文。該論文利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（single-molecule FRET）直接觀測Cas12a復(fù)合體切割過程中動態(tài)構(gòu)象變化，建立了相應(yīng)的定量動力學(xué)模型，并揭示了crRNA和DNA的匹配度對復(fù)合體動態(tài)結(jié)構(gòu)和切割位點調(diào)節(jié)機制。
Cas12a蛋白（又稱Cpf1）在哺乳動物的基因編輯中展現(xiàn)出了比Cas9蛋白更高的切割特異性。因此Cas12a切割雙鏈DNA的分子機制受到了研究者的廣泛關(guān)注。該研究利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過標(biāo)記在crRNA和DNA上的熒光FRET對，來直接觀測LbCas12a復(fù)合體在切割雙鏈DNA過程中的動態(tài)構(gòu)象變化，最終構(gòu)建的定量動力學(xué)模型如圖。首先，Cas12a/crRNA二元復(fù)合物識別靶標(biāo)DNA序列，形成三元復(fù)合物，并在PAM序列近端開始形成R-loop（low FRET態(tài)）。隨著R-loop的進一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，并且使得非互補鏈（NTS）從雙鏈DNA結(jié)構(gòu)解開，將切割位點暴露出來，以完成NTS鏈的切割（medium FRET態(tài)）。斷裂的NTS鏈穩(wěn)定了Cas12a復(fù)合體的互補鏈(TS)切割構(gòu)象（high FRET態(tài)），以完成對TS鏈的切割。
通過以上模型，該研究揭示了Cas12a切割雙鏈DNA過程中的重要分子機制。1）Cas12a結(jié)合和切割DNA過程中高度可逆的動態(tài)過程是導(dǎo)致其高特異性的重要因素之一；2）非互補鏈（NTS）從雙鏈DNA上解開以暴露其切割位點這一過程，晚于Cas12a核酸酶活性的激活過程，是切割中重要的校驗步驟；3）只有斷裂的NTS鏈，才能穩(wěn)定Cas12a復(fù)合體的互補鏈(TS)切割構(gòu)象，從而確保了Cas12a利用單個結(jié)構(gòu)域?qū)蓷lDNA鏈有序的切割過程；4）Cas12a復(fù)合體存在多個互補鏈(TS)切割構(gòu)象，可切割產(chǎn)生不同長度的產(chǎn)物，而切割構(gòu)象的相對穩(wěn)定性受到crRNA和DNA的匹配度的調(diào)控。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來研究員為本文通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院直博生張璐嘉為本文第一作者，孫瑞瑞、楊夢銥、彭思佳和程永新也為本工作做出了重要貢獻。研究使用的LbCas12a表達質(zhì)粒由哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院黃志偉教授惠贈。該工作獲得了國家自然科學(xué)基金委、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心及北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的經(jīng)費支持。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005
相關(guān)論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
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