Molecular Plant Pathology—陳功友團(tuán)隊研發(fā)了一套用于水稻黃單胞菌基因表達(dá)研究的模塊質(zhì)粒組裝系統(tǒng)
2021年1月24日，Molecular Plant Pathology在線發(fā)表了上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院陳功友課題組題為“An improved, versatile and efficient modular plasmid assembly system for expression analyses of genes in Xanthomonas oryzae”的研究論文。該研究研發(fā)了一套模塊質(zhì)粒組裝系統(tǒng)，解決了適用于水稻黃單胞菌的低拷貝載體DNA遺傳操作效率低的瓶頸，將功能DNA模塊，通過高拷貝的遺傳操作背景，轉(zhuǎn)移至低拷貝的骨架載體上，用于基因的蛋白表達(dá)、啟動子活性、突變體的功能互補(bǔ)以及病原菌的病程示蹤等研究。
植物病原黃單胞菌（Xanthomonas spp.）能夠引起400多種植物的病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在水稻上，由稻黃單胞菌(X. oryzae)的2個致病變種水稻白葉枯病菌（X. oryzae pv.?oryzae, Xoo）和條斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)引起的白葉枯病和條斑病是水稻生產(chǎn)上非常重要的2個細(xì)菌病害，嚴(yán)重威脅我國水稻的安全生產(chǎn)。Xoo和Xoc與水稻的互作已作為病原細(xì)菌致病機(jī)制和寄主組織特異性研究的模式系統(tǒng)。
Xoo和Xoc菌株存在較嚴(yán)格的限制性修飾系統(tǒng)，僅允許一些具有寬廣宿主范圍（broad-host-range）的載體在其細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定存在，這些載體一般為低拷貝，加大了DNA遺傳操作的難度。因此，突破這個技術(shù)瓶頸，建立高效的基因表達(dá)研究的載體系統(tǒng)具有重要的意義。
圖1：模塊質(zhì)粒組裝系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用
該研究設(shè)計出了一套模塊化質(zhì)粒組裝系統(tǒng)，利用高拷貝的入門載體（Entry?vector）和目標(biāo)載體（Destination vector），結(jié)合合成生物學(xué)的方法，將基因表達(dá)的核心元件形成模塊，通過組裝的方式，將融合元件在高拷貝質(zhì)粒的遺傳操作背景下轉(zhuǎn)入低拷貝的“骨架”載體（Backbone vector），將陽性克隆的獲得率提高了20倍。作者證明了這套模塊化質(zhì)粒系統(tǒng)能夠在體外、寄主水稻和非寄主煙草的互作環(huán)境下，有效應(yīng)用于Xoo和Xoc毒性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白表達(dá)分析。另外，在骨架載體中引入不同的終止子元件，能夠賦予目的蛋白不同的表達(dá)水平，可以根據(jù)不同的實驗需要來定制目標(biāo)基因的表達(dá)水平，應(yīng)用于基因突變體的功能互補(bǔ)研究。
這套載體系統(tǒng)簡單、高效、多功能，且經(jīng)濟(jì)成本低，也突破了原有體系的局限性，能夠在活體植物組織中進(jìn)行基因表達(dá)的定量測定。因其寬廣的宿主特性，也適用于其他植物病原黃單胞菌。
上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院鄒麗芳副教授和已畢業(yè)的碩士研究生張翠萍為共同第一作者，陳功友教授為通訊作者。課題組的碩士生李逸朗和已畢業(yè)的碩士生楊小菲、王艷艷也參與了該研究工作。美國University of?Wisconsin Milwaukee的Ching-Hong Yang教授也參與了該研究工作。該研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)專項（2017YFD0200400）、國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（31830072）和面上項目（31772122）的資助。
論文鏈接：https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/mpp.13033
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