清華大學生命學院楊茂君教授及其團隊在線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)研究領域取得重要研究進展
2019年6月14日，清華大學生命科學學院楊茂君教授及其研究團隊，在國際頂級期刊《科學》（Science）雜志發(fā)表了題為《結合IF1抑制蛋白的哺乳動物ATP合酶四聚體冷凍電鏡結構》（Cryo-EM structure of the mammalian ATP synthase tetramer bound with inhibitory protein IF1）的研究長文，通過高性能冷凍電鏡技術，解析了分子量高達280萬道爾頓的哺乳動物ATP合酶四聚體6.2埃的結構，以及完整的（19種亞基）、兩種狀態(tài)的ATP合酶單體3.34埃和3.45埃結構（圖1）。通過對結構的分析，闡釋了高等哺乳動物ATP合酶的結構組成樣式、發(fā)揮功能的分子機理、復合物之間協(xié)同關系以及對線粒體嵴的形態(tài)的影響，為治療能量代謝疾病、神經(jīng)退行疾病等，提供了重要的實驗依據(jù)及結構基礎。
楊茂君教授研究團隊長期致力于線粒體呼吸鏈蛋白的結構與功能研究，此前曾于2012年在《自然》（Nature）雜志報道了II-型線粒體呼吸鏈復合物I（NDH2）的結構，揭示了其調控及電子傳遞機制；2017年楊教授研究團隊又分別在《PCCP》、《JMC》等雜志連續(xù)報道了NDH2的詳細電子傳遞機制，為開發(fā)新的抗瘧藥物打下了良好的基礎。
經(jīng)過多年的努力，楊茂君教授研究團隊于2016年終于攻克了哺乳動物線粒體呼吸鏈超級復合物的原子分辨率結構這一難題。2017年，楊茂君教授研究團隊經(jīng)過大量探索，首次從體外培養(yǎng)的人源細胞中分離、純化出高純度的呼吸鏈蛋白復合物，并且首次發(fā)現(xiàn)并解析了人源超超級復合物I2III2IV2中高分辨率三維結構。人源線粒體呼吸鏈復合物純化方法的建立及其結構的解析，為今后的藥物研發(fā)打下了良好的基礎。此外，楊教授研究團隊還在高等動物呼吸鏈復合物III非對稱結構、人源呼吸鏈復合物IV 14亞基完整結構等方面取得重要的進展。
在此次發(fā)表的論文中，楊茂君教授研究團隊首次分離、純化出哺乳動物ATP合酶四聚體蛋白。由于該四聚體蛋白由多達120個亞基組成，各個亞基排布松散，非常不穩(wěn)定，如果增加純化步驟提高純度會一定程度破壞其完整性；相反，粗提取的蛋白不能滿足冷凍電鏡樣品的要求，目的顆粒所占比例過低，無法收集到足夠多的蛋白顆粒用于計算。面對這樣的難題，楊茂君教授研究團隊通過反復實踐，優(yōu)化實驗條件，在兩者之間選取了很好的平衡點，既保證了該超大復合物蛋白的完整性，同時又滿足了冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集的要求。
然而，由于該結構過于巨大，且存在多種構象，在嘗試了幾乎所有能夠利用的計算程序和方法之后，依然無法得到該超大蛋白質機器的高分辨率結構。在對初步計算結果深度分析之后，楊教授敏銳的發(fā)現(xiàn)，在該H型的ATP合酶四聚體蛋白中，對角的兩個ATP合酶復合物單體具有相似的構象。進而楊教授采用了一種新的計算方法，將四聚體中四個ATP合酶拆分后重新居中，然后單獨挖出顆粒，進而將對角構象相似的顆粒合并。這樣做不僅極大的縮小了計算中的分子尺度，而且還能提高顆粒數(shù)量。在后續(xù)的計算中逐步將這兩類不同構象的ATP合酶復合物單體的分辨率提高到了原子分辨率水平。
對于這種新穎的純化及計算方法，審稿專家給予了高度的評價：“Their approach of mild, partial purification combined with the collection of a large image data set will open new avenues in the structural biology of highly fragile complexes that are not amenable to standard purification procedures”（他們將溫和、部分提取純化的方法與大數(shù)據(jù)收集相結合，該方法將為不能采用常規(guī)純化手段獲得的、高度脆弱的蛋白復合物的結構生物學研究開辟新的途徑）。
文章重點報道了目前發(fā)現(xiàn)的最完整的哺乳動物ATP合酶單體結構，以及各個亞基在復合物中的位置和功能。ATP合酶單體是由19種不同的亞基，共有30個蛋白來構成的超大復合物。新鑒定的亞基多包裹于ATP合酶四聚體中間區(qū)域，意味著只有在四聚體蛋白中才能包含全部亞基。兩種不同構象的ATP合酶單體結構完美的解釋和驗證了哺乳動物ATP合酶合成ATP的分子機制。
ATP合酶四聚體由120個蛋白亞基構成，是由兩個相似的構象的ATP合酶二聚體通過反向平行組合在一起形成一個四聚體，四聚體在跨膜區(qū)形成一個高曲率的曲面，可以很好的解釋它們在線粒體嵴上的排布方式。本次解析的ATP合酶四聚體處于活性抑制狀態(tài)。線粒體內膜上存在大量的蛋白質，其中蛋白與磷脂的比例大約是7:3，ATP合酶分子大約占到所有蛋白的20%左右。大多數(shù)ATP合酶平常都會處于抑制狀態(tài)，只有在細胞需要大量能量的時候才會被激活合成ATP分子。
本次研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶四聚體在多個位點上實行協(xié)同抑制-激活機制。當線粒體基質質子濃度升高，內膜兩側質子濃度差降低時，IF1蛋白亞基會通過其C端形成二聚體，其N端深深的插入到ATP合酶行使催化功能的F1部分，阻止ATP合酶催化亞基構象變化，使其不能合成ATP分子。二聚的IF1將ATP合酶四聚體中F1部分兩兩固定的在一起。當線粒體基質質子濃度降低時，質子濃度差升高時，IF1蛋白會形成四聚體，將其N端從ATP合酶的F1部分抽離出來，解除這種抑制。與此同時，質子濃度差降低時，在ATP合酶的膜間隙一側，e亞基的C端會與位于c8-ring中間的6.8PL亞基的C端結合，進而抑制c8-ring的轉動。反之，抑制解除。總而言之，ATP合酶可以感知線粒體內膜兩側質子梯度的變化，進而調整其活性。
在文章的審稿過程中，審稿人對于該研究給予了很高的評價“The IF1-inhibited tetramer structure is a “first” for any F-ATP synthase and also the first truly intact structure of a mammalian enzyme, a feat that has eluded structural biologists for decades despite intense efforts in many labs across the world.”（IF1抑制的四聚體結構是“第一個”F型ATP酶的四聚體結構，也是哺乳動物ATP合酶第一個真正意義上的完整結構，幾十年來，世界范圍內眾多結構生物學家為之進行了大量的努力，都沒能完成楊教授團隊這樣的壯舉）。楊茂君教授研究團隊將再接再厲對線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)進行更加深入的研究，并將致力于研發(fā)治療線粒體異常疾病的新型靶向藥物。
清華大學生命科學學院谷金科（博士后）、張來幸（15級博士生）、宗帥（結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者）、郭潤域（結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者、水木學者）是此篇論文的共同第一作者，楊茂君教授為本文的通訊作者。劉天涯（16級）、易靜波（18級）、卓微（博士后）也參與了相關研究工作。此外特別感謝南方科技大學冷凍電鏡中心主任王培毅教授，沒有王教授在關鍵時刻給予的大力支持，就沒有此工作的順利開展和取得這一重大研究進展。本工作受到了科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委、清華大學結構生物學高精尖中心、清華-北大生命科學聯(lián)合中心及清華大學自主科研計劃的大力支持。
圖1 哺乳動物ATP合酶四聚體整體結構
原文鏈接：https://science.sciencemag.org/content/364/6445/1068
相關論文鏈接：https://www.nature.com/articles/nature11541；
https://doi.org/10.1038/nature19359；
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(16)31533-1；
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30887-5
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13238-018-0515-x；
http://dx.doi.org/10.1038/s41422-018-0071-1。
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