?????? 2018年7月19日，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)研究中心吳強教授課題組在國際著名期刊Molecular Cell《分子細(xì)胞》上在線發(fā)表了題為“Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-mediated Nucleotide Insertion《精準(zhǔn)且可預(yù)測的CRISPR染色體重排揭示Cas9介導(dǎo)的堿基插入規(guī)律》”的最新研究成果，在基因編輯機制方面取得了原始創(chuàng)新性進(jìn)展，顛覆了已有的基因編輯認(rèn)識。揭示了CRISPR/Cas9新一代基因編輯系統(tǒng)全新的切割機理及其在染色體重排和DNA修復(fù)中的作用，實現(xiàn)了精準(zhǔn)的DNA大片段編輯及可預(yù)測的堿基插入。
?????? CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年國際上興起的新一代基因編輯技術(shù)。這一劃時代技術(shù)雖然起源于細(xì)菌和古生菌，但在真菌及高等動物植物基因組改造中，以及農(nóng)業(yè)科學(xué)、生命醫(yī)學(xué)、新藥創(chuàng)制等“卡脖子”領(lǐng)域已得到了迅速而廣泛的應(yīng)用。近年來，借助我國物種多樣性這一優(yōu)勢，國內(nèi)基因編輯研究工作獲得了空前的發(fā)展，取得了一系列重要進(jìn)展，在多個物種的基因編輯技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了國際“并跑”到“領(lǐng)跑”的轉(zhuǎn)變。國際上的基因編輯應(yīng)用研究如火如荼，但對Cas9核酸酶的切割原理和修復(fù)機制研究還比較少。
?????? 從基因打靶技術(shù)在2007年獲得諾貝爾獎后，2012年開始發(fā)展起來的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是最具潛力獲得諾貝爾獎的。自從這一新一代基因編輯系統(tǒng)建立以來，人們普遍認(rèn)為Cas9核酸酶切割DNA雙鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生平頭末端的。特別是早在2012年，CRISPR/Cas9研究的先驅(qū)杜德娜（Doudna）和夏龐蒂埃（Charpentier）發(fā)表在Science的研究論文，以及Siksnys發(fā)表在PNAS的研究論文，發(fā)現(xiàn)Cas9切割DNA產(chǎn)生平頭末端，前者進(jìn)一步報道體外斷裂實驗所觀察到的現(xiàn)象是由于Cas9核酸酶的核酸外切活性所導(dǎo)致的，Cas9具有核酸外切酶活性。
?????? 上海交大吳強團(tuán)隊通過開發(fā)DNA片段編輯技術(shù)，結(jié)合高通量測序技術(shù)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Cas9核酸酶通過核酸內(nèi)切酶活性切割DNA雙鏈能夠產(chǎn)生突出末端，而不僅僅是之前報道的平頭末端切割方式，Cas9不具有核酸外切酶活性，而僅具有核酸內(nèi)切酶活性。同時發(fā)現(xiàn)通過基因工程改造后的Cas9核酸酶具有不同的突出末端切割模式，從Cas9核酸酶的結(jié)構(gòu)上更進(jìn)一步證明了Cas9切割的多樣性。綜上所述，該研究從根本上顛覆了人們對Cas9核酸酶切割DNA的既有認(rèn)識，可能成為CRISPR/Cas9新一代基因編輯系統(tǒng)基礎(chǔ)研究具有轉(zhuǎn)折意義的發(fā)現(xiàn)和原始創(chuàng)新，為優(yōu)化和改造基因編輯技術(shù)奠定了堅實基礎(chǔ)。
?????? 腫瘤疾病是目前困擾人類的最大難題之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多基因且與環(huán)境共同作用的結(jié)果。染色體重排在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，例如治療白血病的“神藥”格列衛(wèi)的原始靶點就是由染色體重排產(chǎn)生的。染色體重排包括染色體的大片段缺失、反轉(zhuǎn)、重復(fù)和易位等，通常與惡性腫瘤密切相關(guān)。當(dāng)三維基因組染色體結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在基因的編碼區(qū)時，會造成基因的異位或非正常表達(dá)，或引起基因拷貝數(shù)的變化，從而影響基因調(diào)控和基因功能。當(dāng)染色體結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在基因的非編碼區(qū)時，也會通過長距離染色質(zhì)環(huán)化的改變，進(jìn)一步影響三維基因組染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)異常，從而造成基因調(diào)控與基因功能的改變。最近新興的基因編輯和DNA片段編輯技術(shù)為三維基因組染色體異常等相關(guān)疾病的根本病因的研究和最終治療手段提供了重要技術(shù)支持。尤其是利用CRISPR基因編輯技術(shù)構(gòu)建特定的三維基因組染色體結(jié)構(gòu)變異疾病模型，能夠極大的促進(jìn)對惡性腫瘤的發(fā)生機制及治療手段的研究，同時理解染色體異常的DNA損傷修復(fù)機制也能為潛在的腫瘤治療手段提供支持。
?????? 吳強團(tuán)隊長期致力于利用基因打靶和基因編輯技術(shù)研究基因組DNA大片段敲除或編輯。早在2015年，課題組博士生李金環(huán)和壽佳合作發(fā)表了關(guān)于DNA片段編輯的研究工作，闡述了利用CRISPR雙切點的DNA片段編輯機制，開發(fā)了基因組DNA大片段編輯技術(shù)，包括反轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件、敲除基因簇、重復(fù)DNA片段等。這種技術(shù)方法比傳統(tǒng)的通過同源重組獲得的DNA片段重排方法更為高效，為研究三維基因組大量未知元件的調(diào)控機制以及癌細(xì)胞染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變異提供了便利手段。同年，該團(tuán)隊利用這一DNA片段遺傳編輯技術(shù)對基因組特定遺傳元件進(jìn)行反轉(zhuǎn)，結(jié)合計算生物學(xué)，發(fā)現(xiàn)了CTCF位點和方向在三維基因組染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)折疊的重要規(guī)律，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在Cell雜志上。課題組利用基因編輯技術(shù)研究原鈣粘蛋白腦發(fā)育功能也獲得了重要進(jìn)展，于2018年6月份發(fā)表于eLife雜志上。
?????? 該研究在前期工作積累的基礎(chǔ)上，在Cas9核酸酶的切割原理及細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機制方面取得了原始創(chuàng)新，顛覆了該研究領(lǐng)域的原有認(rèn)知。CRISPR基因編輯工具利用Cas9核酸酶結(jié)合靶標(biāo)特異性RNA分子對基因組DNA特定區(qū)段進(jìn)行靶向切割，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后在細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接修復(fù)通路的作用下（普遍認(rèn)為細(xì)胞的同源修復(fù)通路是精準(zhǔn)的，而非同源末端連接修復(fù)通路是隨機的），對DNA斷裂末端進(jìn)行修復(fù)，從而造成隨機插入刪除。該研究通過敲除或干擾在癌癥中起到關(guān)鍵作用的DNA修復(fù)蛋白，能夠顯著提高精準(zhǔn)的DNA片段編輯效率，同時證明細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接修復(fù)通路也是一種精準(zhǔn)的DNA修復(fù)方式。
?????? 此外，該研究利用高通量測序技術(shù)對DNA片段編輯的雙鏈斷裂末端進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，斷裂末端的核苷酸加入呈現(xiàn)非常有規(guī)律的模式。通過一對導(dǎo)向RNA分子的四種不同切割構(gòu)型，結(jié)合測序技術(shù)和基因工程技術(shù)，證明Cas9介導(dǎo)的堿基插入在DNA片段編輯中是能夠預(yù)測的。這一可預(yù)測的染色體重排規(guī)律，為研究人類染色體異常引起腫瘤等相關(guān)疾病提供技術(shù)支持，進(jìn)而推動相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。
?????? 該研究獲得了評審專家的高度肯定：“該工作很有趣很有意思，該研究對于預(yù)測Cas9介導(dǎo)的DNA片段編輯結(jié)果很有幫助”；“DNA大片段編輯的選題以及對DNA修復(fù)的意義很有相關(guān)性，很有意義，實驗數(shù)據(jù)尤其引人注目，該研究很可能在基因編輯以及構(gòu)建染色質(zhì)重排的多種疾病模型領(lǐng)域引發(fā)廣泛的興趣”；“該研究為可預(yù)測的DNA片段編輯提供了嶄新證據(jù)，實驗設(shè)計好，實驗結(jié)果質(zhì)量高，Cas9核酸內(nèi)切酶活性切割DNA形成突出末端是一項非常意外的發(fā)現(xiàn)，也是一項重大發(fā)現(xiàn)?！?/p>
?????? 總之，該研究首次開發(fā)了通過調(diào)控細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)實現(xiàn)精準(zhǔn)的DNA片段編輯方法，以及通過研究DNA片段編輯接頭處的特定堿基加入，從而實現(xiàn)了可預(yù)測的DNA片段編輯。這項研究為進(jìn)一步理解DNA雙鏈斷裂修復(fù)機制，以及三維基因組DNA片段的編輯應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。在基因組編輯工具CRISPR技術(shù)飛速發(fā)展的今天，該研究系統(tǒng)的闡述了如何利用細(xì)胞內(nèi)修復(fù)蛋白介導(dǎo)精準(zhǔn)的DNA片段編輯，有望推動三維基因組染色體異常等遺傳疾病的相關(guān)研究。
?????? 該研究由上海交通大學(xué)獨立完成，吳強為通訊作者，交大博士生壽佳和博士后李金環(huán)為共同第一作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金委員會和科技部的資助。
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論文鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30466-0
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作者：壽佳，李金環(huán)
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