吳起課題組：【酶催化】光脫羧酶催化外消旋羧酸的選擇性脫羧反應(yīng)
帶有α-官能團(tuán)的手性羧酸是很多藥物和天然產(chǎn)物的重要中間體或者結(jié)構(gòu)砌塊。目前已經(jīng)有很多制備含α-官能團(tuán)的手性羧酸的合成方法。通常的化學(xué)合成法需要用到過渡金屬催化劑和復(fù)雜的手性配體。與化學(xué)法相比，生物催化可以以更加綠色和可持續(xù)的方式制備這一類重要的手性化合物。例如酮還原酶和亞胺還原酶都已經(jīng)成功地用于從α-酮酸到α-羥基/氨基酸的轉(zhuǎn)化，此外水解酶催化的酯或者酸的動(dòng)力學(xué)拆分也是廣泛使用的方法。然而這些生物催化方法通常需要輔因子的參與或者將酸提前制備為相應(yīng)的酯或酰胺化合物。因而探索更加簡單高效且不需輔因子的新型生物催化方法制備含α-官能團(tuán)的手性羧酸顯得極為重要。
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化學(xué)系的吳起課題組最近報(bào)道了一種利用光脫羧酶來高效拆分含α-官能團(tuán)的外消旋羧酸的新方法。他們選擇了一種來源于小球藻（Chlorella variabilis）NC64A的脂肪酸光脫羧酶（CvFAP）作為催化劑，以2-羥基辛酸的脫羧反應(yīng)為模型開展研究。CvFAP可將不同鏈長（C12-C22）的脂肪酸在無任何輔助因子的作用下脫羧生成相應(yīng)的烷烴或者烯烴。他們?cè)O(shè)想CvFAP的催化空腔可能對(duì)外消旋酸具有立體選擇性，從而可以利用脫羧反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)外消旋羧酸的手性拆分。然而，研究發(fā)現(xiàn)野生型CvFAP的催化活性較差，12小時(shí)光照反應(yīng)后只有20%的底物轉(zhuǎn)化率，底物的對(duì)映體過量值（ee）只有22%。為了解決該問題，他們對(duì)CvFAP進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程化改造。
圖1. 基于CvFAP酶進(jìn)行含α-官能團(tuán)的羧酸的光驅(qū)動(dòng)動(dòng)力學(xué)拆分。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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定向進(jìn)化中無論是隨機(jī)突變還是飽和突變，突變株篩選的工作量都非常龐大。因此，他們?cè)谖恼轮胁捎昧嘶凇按蟀被釖呙琛辈呗缘睦硇栽O(shè)計(jì)方法，結(jié)合CvFAP酶的晶體結(jié)構(gòu)，選擇了A384、L386和G462三個(gè)位點(diǎn)，將原有位點(diǎn)的氨基酸通過定點(diǎn)突變替換為包括Q、K、F和Y在內(nèi)的大體積氨基酸。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株G462Y最好，可以在51%的轉(zhuǎn)化率下獲得99%ee值的R-構(gòu)型底物。動(dòng)力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明G462Y突變株的活性相比野生型提高了30倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)G462Y突變株具有較廣泛的底物譜，一系列具有C6-C12不同鏈長或者具有不同取代基的α-羥基酸、以及α-氨基酸都能獲得良好的手性拆分結(jié)果。分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)在C462Y突變株中，活性位點(diǎn)周圍的一些氨基酸有助于穩(wěn)定R-構(gòu)型底物，阻止它靠近FAD輔因子；而S-構(gòu)型底物則與FAD中的N5原子具有更小的距離，從而使得S-構(gòu)型羧酸底物更容易發(fā)生脫羧反應(yīng)。
表1. 在選擇位點(diǎn)引入大體積氨基酸（Q、K、F和Y）的效果評(píng)估。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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圖2. 野生型CvFAP和C462Y突變體的光驅(qū)動(dòng)動(dòng)力學(xué)拆分的底物范圍。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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該研究第一次實(shí)現(xiàn)了光脫羧酶CvFAP的立體選擇性脫羧反應(yīng)，為手性羧酸的合成提供了一種新的方法，有望在制藥、綠色有機(jī)合成等領(lǐng)域中獲得重要的應(yīng)用。
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這一成果近日發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上。該文章的第一作者是化學(xué)系的博士生徐鑒，通訊作者為吳起副教授。
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Light?Driven Kinetic Resolution of α?Functionalized Carboxylic Acids Enabled by an Engineered Fatty Acid Photodecarboxylase
Jian Xu, Yujing Hu, Jiajie Fan, Mamatjan Arkin, Danyang Li, Yongzhen Peng, Weihua Xu, Xianfu Lin, Qi Wu
Angew. Chem. Int. Ed.,?2019,?58, 8474-8478, DOI: 10.1002/anie.201903165
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科研思路分析
Q：這項(xiàng)研究最初是什么目的？或者說想法是怎么產(chǎn)生的？
A：我們課題組的研究興趣是探索各種酶催化的新功能，以實(shí)現(xiàn)生物催化在有機(jī)合成領(lǐng)域中更廣泛的應(yīng)用。光脫羧酶CvFAP是法國Beisson教授和合作者于2017年最早發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的一個(gè)能利用光能的酶（Science,?2017,?357, 903?907）。該酶催化的天然底物都是一些長鏈的脂肪酸，產(chǎn)物是一些沒有手性中心的烷烴或者烯烴。酶作為一類具有高度立體選擇性的催化劑，其手性空腔可以通過定向進(jìn)化等蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，我們?cè)O(shè)想CvFAP脫羧酶的催化中心也應(yīng)該是具有立體選擇性的特質(zhì)，如果底物是外消旋羧酸的話，很可能會(huì)導(dǎo)致兩種構(gòu)型羧酸的脫羧反應(yīng)的活性區(qū)別，從而實(shí)現(xiàn)羧酸的高效拆分。而這樣的酶催化拆分反應(yīng)是從來沒有報(bào)道過的。
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Q：研究過程中遇到哪些挑戰(zhàn)？
A：正如文中所述，野生型CvFAP對(duì)這些外消旋羧酸的反應(yīng)活性很弱，雖然對(duì)于某些底物野生型CvFAP也體現(xiàn)出了較高的立體選擇性，但是由于產(chǎn)物是沒有手性的，因此難以獲得高光學(xué)純度的α-取代羧酸化合物。因此，本項(xiàng)研究中最大的挑戰(zhàn)是如何提高CvFAP酶的催化活性。雖然酶的定向進(jìn)化研究已經(jīng)有了很多的報(bào)道，但是我們團(tuán)隊(duì)在酶蛋白質(zhì)工程的理性設(shè)計(jì)方面的經(jīng)驗(yàn)積累起了至關(guān)重要的作用（J. Am. Chem. Soc.,?2019,141(19): 7934-7945;?Chem. Commun.,?2019,?55, 2198-2201;?Adv. Synth. Catal.,2019,?361, 126-134;?ACS Catal.,?2017,?7, 4542?4549），可以讓我們?cè)谏倭客蛔冎旰Y選的基礎(chǔ)上就可以獲得我們所需要的目標(biāo)突變株。
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Q：該研究成果可能有哪些重要的應(yīng)用？哪些領(lǐng)域的企業(yè)或研究機(jī)構(gòu)可能從該成果中獲得幫助？
A：帶有α-官能團(tuán)的手性羧酸是很多藥物和天然產(chǎn)物的重要中間體或者結(jié)構(gòu)砌塊。正如文中所述，我們發(fā)展的光脫羧酶催化外消旋羧酸的立體選擇性拆分方法，和以前所報(bào)道的化學(xué)法、酶還原法或者水解酶催化拆分方法相比，具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如光引發(fā)、不需要輔酶循環(huán)、以及酸底物的衍生化等。我們相信這項(xiàng)研究為手性羧酸的合成提供了一種新的方法，有望在制藥、綠色有機(jī)合成等領(lǐng)域中獲得重要的應(yīng)用。
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?來源：X-MOL微信公眾號(hào)
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