????由于不同的對映異構(gòu)體可能具有不同的生理活性,甚至可能存在嚴重的毒副作用,因此分子手性與其生物活性之間的關(guān)系受到人們廣泛的關(guān)注。而隨著分子中手性中心的增加,兩者之間關(guān)系的復(fù)雜性會急劇增加。雖然不對稱合成技術(shù)在過去幾十年中得到了極大的發(fā)展,但是對于反應(yīng)過程中立體構(gòu)型的控制,特別是實現(xiàn)多手性中心化合物的每一種構(gòu)型產(chǎn)物的合成,仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。
????酶催化的立體多樣性合成方法的研究相對于其他酶催化研究領(lǐng)域而言,發(fā)展相對緩慢。究其原因是天然酶的專一性比較高,因此很難利用同一種酶來實現(xiàn)對一個多手性中心化合物的每一種構(gòu)型產(chǎn)物的合成。雖然酶的定向進化技術(shù)已經(jīng)在調(diào)控酶的立體選擇性方面得到了廣泛應(yīng)用,但是立體選擇性多樣化的酶定向進化研究則很少有報道。?
????最近,我系吳起副教授課題組與德國馬普煤炭所的Manfred T. Reetz教授、上海有機所周佳海研究員以及英國貝爾法斯特女王大學(xué)的黃美蘭博士合作,以南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase?B, CALB)催化的有機相中外消旋酸和外消旋醇的酯交換反應(yīng)為模型,利用一種基于定向進化和設(shè)計相融合的高效的蛋白質(zhì)工程改造策略基于定向進貨和理財設(shè)計相融合的高效的蛋白質(zhì)工程改造策略――“Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis” (FRISM),以極小的突變株篩選工作量,得到了分別對四種構(gòu)型產(chǎn)生具有高度立體選擇性的CALB突變株,目標構(gòu)型的選擇性都在90%以上,晶體結(jié)構(gòu)解析和非水相的分子動力學(xué)模擬計算較好地解釋了四種突變株的特定立體選擇性的產(chǎn)生原因和分子機制。文章近日發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上。
圖1:基于FRISM的突變庫構(gòu)建策略。圖片來源:JACS
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圖2:由CALB突變株催化的2-苯基丙酸對硝基苯酚酯和1-苯乙醇之間的酯交換模型反應(yīng)。圖片來源:JACS
圖3:利用FRISM得到的四種CALB突變株對模型反應(yīng)的不同選擇性。圖片來源:JACS
?????? 利用FRISM技術(shù),在篩選的關(guān)鍵氨基酸位點引入A/L/F作為不同體積大小的氨基酸突變,根據(jù)最佳突變再加入少許相似大小的氨基酸作為擴展(A+: G; L+: V/C/I/M; F+: Y/W),每種選擇性的突變庫中突變株數(shù)量不多于25個,可以高效地實現(xiàn)對所有四種可能的立體異構(gòu)體都達到了>90%的選擇性。在四種選擇性突變株的底物譜研究中發(fā)現(xiàn)突變株SacidRalco、RacidSalco與RacidRalco都具有較寬的底物適用性,而突變株SacidSalco的底物譜相對比較窄。?
表1:四種CALB突變株的底物譜。圖片來源:JACS
???? 在對野生型CALB以及四種不同立體選擇性突變株的動力學(xué)對比分析中,發(fā)現(xiàn)野生型CALB對(Racid, Ralco)和(Sacid, Ralco)構(gòu)型的底物有相似的活性,而對于(Racid, Salco)和(Sacid, Salco)構(gòu)型的底物活性很低,說明了野生型CALB對手性仲醇的嚴格選擇性起到了重要的作用。而另一方面,每個突變株的動力學(xué)參數(shù)也說明了其本身明顯的構(gòu)型選擇優(yōu)勢。為了更好的理解不同構(gòu)型底物與特定蛋白質(zhì)之間的關(guān)系,研究者對四種突變株蛋白進行結(jié)晶,得到的結(jié)構(gòu)表明在不同的突變株中,對醇結(jié)構(gòu)或者酸結(jié)構(gòu)有相同選擇性的晶體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出相似的蛋白選擇性口袋形狀。?
?? 最后,研究者在解析四種突變體晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,利用分子動力學(xué)模擬闡述了四種突變株不同選擇性的來源。在同一突變株中,底物分子的羰基C原子與CALB的催化中心105位絲氨酸的羥基O原子的最短距離都證明是最優(yōu)構(gòu)型的距離。同樣的結(jié)果在計算得到的結(jié)合焓中也得以體現(xiàn),結(jié)合焓越小,此突變株對特定構(gòu)型的選擇性越大。?
???本文通過理性設(shè)計和定向進化的有機結(jié)合,調(diào)控活性位點中關(guān)鍵氨基酸的某一特性(本文中以A/L/F作為調(diào)控氨基酸體積大小的突變),在單位點篩選結(jié)果基礎(chǔ)上,進一步進行理性設(shè)計的多位點組合迭代突變,構(gòu)建高度聚焦的小型突變庫,實現(xiàn)了對4種手性選擇性的分別調(diào)控。該方法僅需最小量的篩選,大大減少了工作量,相比于飽和突變,更加突顯出人工理性設(shè)計策略的重要以及先進性,為以后酶的立體多樣性定向進化提供了借鑒。該文章的共同第一作者是浙江大學(xué)化學(xué)系的博士生徐鑒和?一欣。周佳海研究員、黃美蘭博士、Manfred T. Reetz教授和吳起副教授為共同通訊作者。
?原文:
Stereodivergent Protein Engineering of a Lipase To Access All Possible Stereoisomers of Chiral Esters with Two Stereocenters
Jian Xu, Yixin Cen, Warispreet Singh, Jiajie Fan, Lian Wu, Xianfu Lin, Jiahai Zhou,* Meilan Huang,* Manfred T. Reetz,* Qi Wu*
J. Am. Chem. Soc.,?2019,?141, 7934-7945, DOI: 10.1021/jacs.9b02709
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來源:X-MOL微信公眾號
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