李雪明課題組在《結(jié)構(gòu)生物學(xué)報》上發(fā)表論文報道一種利用聚焦離子束制備蛋白微晶電子衍射樣品的技術(shù)
2019年2月20日，清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明課題組在《結(jié)構(gòu)生物學(xué)報》（Journal of Structural Biology）雜志上在線發(fā)表題為《利用聚焦離子束制備微晶電子衍射樣品切片》（Using Focus Ion Beam to Prepare Crystal Lamella for Electron Diffraction）的研究論文。該研究為電子衍射技術(shù)提供了一種新的樣品制備方法，彌補了以往樣品制備方法中的局限，拓展了電子衍射技術(shù)的使用范圍。
利用微晶電子衍射技術(shù)（MicroED）解析晶體結(jié)構(gòu)日益成為冷凍電子顯微學(xué)（cryoEM）的一個重要分支。由于電子與物質(zhì)具有很強的相互作用，電子衍射可以用來解析X射線同步輻射光源無法解析的亞微米級別的微小晶體的結(jié)構(gòu)。然而，極強的電子與物質(zhì)相互作用也限制了晶體厚度不能超過0.5微米，過厚的晶體會導(dǎo)致電子不能透射或產(chǎn)生嚴重的動力學(xué)散射效應(yīng)，使得衍射點的強度產(chǎn)生偏差而難以解析結(jié)構(gòu)。為了達到電子衍射要求的樣品厚度，現(xiàn)有樣品制備方法通常是篩選小晶體或者利用機械力將大塊晶體破碎，尋找晶體較薄的邊緣用于收集數(shù)據(jù)，然而這種方法具有很多不可控因素，在現(xiàn)實中難以操作，且易對脆弱晶體造成損傷。
李雪明課題組借鑒了已在冷凍電子斷層成像（cryoET）中應(yīng)用的聚焦離子束（FIB）切割技術(shù)，使用匯聚的離子束對大塊晶體進行切割，使之滿足電子衍射的厚度要求，成功制備了高質(zhì)量的晶體切片，并將兩個測試蛋白的結(jié)構(gòu)解析到1.5 
和1.7 ，基本消除了電子衍射對晶體大小的限制。同時，李雪明課題組還研究了聚焦離子束切割對晶體造成輻照損傷，發(fā)現(xiàn)從單一方向?qū)w噴鍍Pt保護層難以覆蓋多面體形狀晶體的全部表面，從而導(dǎo)致嚴重的表面輻照損傷。實驗發(fā)現(xiàn)，從雙束掃描電鏡（SEM/FIB）的電子束和離子束兩個方向噴鍍可以有效減少輻照損傷。利用FIB切割可以控制樣品厚度的特性，本研究發(fā)現(xiàn)晶體切片的最佳厚度范圍為150-250nm，過薄的樣品通常比較脆弱，容易在轉(zhuǎn)移的過程中損壞，而過厚的樣品易于發(fā)生動力學(xué)散射效應(yīng)，導(dǎo)致分辨率和衍射數(shù)據(jù)質(zhì)量明顯下降。此外，本研究還探索了晶體切片的微小形變對電子衍射花樣和強度的影響，為后續(xù)研究鋪墊了道路。本研究解決了電子衍射樣品制備的技術(shù)瓶頸，將有力地推進電子衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)或者有機分子晶體的結(jié)構(gòu)測定中的更廣泛應(yīng)用，彌補現(xiàn)有X射線衍射晶體學(xué)技術(shù)的不足，甚至可以作為一種更低成本和更高分辨率的技術(shù)來替代傳統(tǒng)的X射線衍射晶體學(xué)技術(shù)。
清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明研究員為本文的通訊作者，清華大學(xué)生命學(xué)院四年級博士生周珩、羅智璞博士（現(xiàn)任蘇州大學(xué)分子酶學(xué)研究所教授）為本文共同第一作者。
國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺為本研究的樣品制備和數(shù)據(jù)收集提供了支持，清華大學(xué)冷凍電鏡平臺的李曉敏博士和李丹陽對樣品制備提供了技術(shù)幫助。國家自然科學(xué)基金委、科技部重點研發(fā)計劃、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心為本研究提供了經(jīng)費支持。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jsb.2019.02.004
圖1 聚焦離子束蛋白質(zhì)微晶切割、優(yōu)化及結(jié)構(gòu)解析流程圖
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