林愛福課題組Nature Metabolism發(fā)文繪制細(xì)胞器非編碼RNA圖譜并解析功能
線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器組成的結(jié)構(gòu)相對(duì)獨(dú)立、功能緊密聯(lián)系的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，高效支撐了機(jī)體正常生理活動(dòng)功能。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)失衡，胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)異常，造成不可控的細(xì)胞惡性調(diào)控，促使腫瘤等惡性疾病發(fā)生。
不同細(xì)胞器具有各自獨(dú)特的核酸、蛋白、代謝物質(zhì)組成，促進(jìn)了各類生化反應(yīng)的高效運(yùn)轉(zhuǎn)，支持其各自獨(dú)特能量代謝等功能。對(duì)細(xì)胞器蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等分析有效揭示了各細(xì)胞器在能量代謝平衡等重要細(xì)胞活動(dòng)規(guī)律中的獨(dú)特功能和動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)。相對(duì)的，作為細(xì)胞三類主要生物分子組分之一的核酸，其作為細(xì)胞器組分的分布規(guī)律及其參與細(xì)胞代謝功能的研究尚少。因此，對(duì)細(xì)胞器獨(dú)特核酸組分及其相關(guān)作用蛋白、代謝物質(zhì)的精細(xì)研究將是細(xì)胞器調(diào)控能量代謝動(dòng)態(tài)行為解析的重要突破口。
長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNA)作為一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，在細(xì)胞代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控功能。浙江大學(xué)林愛福等課題組在內(nèi)的一系列前期研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜脂結(jié)合LINK-A促進(jìn)了細(xì)胞質(zhì)膜PIP3-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Lin et al., 2017)，細(xì)胞質(zhì)CamK-A介導(dǎo)了Ca2+信號(hào)與NF-κB信號(hào)交互(Sang et al., 2018)，細(xì)胞核BCAR4介導(dǎo)了Hedgehoge-Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)錄協(xié)同(Zheng et al., 2017)，展現(xiàn)了lncRNA生物學(xué)功能與其亞細(xì)胞定位的緊密聯(lián)系。因此，探明LncRNAs細(xì)胞空間層級(jí)分布及其如何在生理病理?xiàng)l件下動(dòng)態(tài)調(diào)控細(xì)胞代謝進(jìn)程及腫瘤病變發(fā)生具有重要意義。
浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林愛福課題組于2021年1月4日在Nature Metabolism雜志在線發(fā)表題為Mitochondrial Long Non-coding RNA GAS5 Tunes TCA Metabolism in Response to Nutrient Stress的研究論文。該研究通過建立細(xì)胞器免疫親和純化體系，繪制了細(xì)胞器lncRNA圖譜，并從中揭示了線粒體lncRNA GAS5在幫助細(xì)胞應(yīng)對(duì)能源匱乏條件，介導(dǎo)TCA循環(huán)代謝區(qū)室解離中的重要調(diào)控作用，為研究lncRNA亞細(xì)胞空間動(dòng)態(tài)調(diào)控與人類疾病發(fā)生的聯(lián)系提供了嶄新的視角。
為了精確解析細(xì)胞器RNA組分分布，研究者們經(jīng)過探索優(yōu)化建立了一套細(xì)胞器免疫親和純化體系。傳統(tǒng)的細(xì)胞器純化方法主要依賴于蔗糖、percoll等介質(zhì)的密度梯度離心法，根據(jù)不同細(xì)胞器的不同沉降系數(shù)將其分離，但是由于一些細(xì)胞器間的沉降系數(shù)范圍重疊（如線粒體、溶酶體）難以達(dá)到精確的RNA檢測(cè)分辨率。此外，近來揭示的大量顆粒狀無膜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，尤其是能抵抗RNase消化的RNA granule類顆粒，往往因其更加離散的沉降系數(shù)而導(dǎo)致在各細(xì)胞器組分中的污染。因此，作者開發(fā)了基于免疫親和純化的細(xì)胞器純化方案，使用簡(jiǎn)化的細(xì)胞勻漿-離心法獲得輕線粒體組分懸液（LMF），再通過線粒體表面標(biāo)志蛋白Tom20或溶酶體表面標(biāo)志蛋白Lamp1的抗體分別捕獲LMF懸液中線粒體及溶酶體組分，最后通過Protein A/G磁珠富集并磁性分離得到免疫親和純化的完整細(xì)胞器。該細(xì)胞器免疫親和純化體系獲得的細(xì)胞器可以極大避免細(xì)胞器間交叉污染及無膜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的串?dāng)_，且因無需提前外源轉(zhuǎn)染或化學(xué)處理細(xì)胞，可以更好保留細(xì)胞器生化表征完整性，適用于不同應(yīng)激條件處理下的各細(xì)胞器組分的動(dòng)態(tài)分析及組織中細(xì)胞器的提取分析。借助上述細(xì)胞器免疫親和純化體系聯(lián)合RNA-seq高通量測(cè)序分析，作者建立了細(xì)胞器lncRNA圖譜。該圖譜顯示免疫親和純化法相比傳統(tǒng)離心方法具有更好的RNA富集效率及分辨效果，揭示了細(xì)胞器lncRNA約占總lncRNA的5.2%。作者進(jìn)一步通過生信分析、qPCR驗(yàn)證、siRNA篩選，揭示了細(xì)胞器lncRNA潛在參與了所在細(xì)胞器相關(guān)功能的調(diào)控。
?圖1 細(xì)胞器免疫親和純化體系流程示意圖及細(xì)胞器lncRNA候選分子的選擇
在所建立的細(xì)胞器lncRNA圖譜中，作者通過細(xì)胞器提取-qPCR篩選了高豐度的細(xì)胞器lncRNA，再通過線粒體/溶酶體定位的葡萄糖敏感性及線粒體ATP產(chǎn)能/溶酶體表面AMPK激活作為指標(biāo)，篩選了具有潛在細(xì)胞器相關(guān)代謝調(diào)控功能的細(xì)胞器lncRNA，包括線粒體能量代謝功能緊密相關(guān)的lncRNA GAS5（Growth-Arrest-Specific 5）。研究者進(jìn)一步通過FISH、線粒體分離-qPCR、ATP檢測(cè)、NADH/NAD+檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GAS5的糖敏感性線粒體定位及其對(duì)線粒體ATP、NADH產(chǎn)生的影響。GAS5已知報(bào)道通過競(jìng)爭(zhēng)抑制GR（glucocorticoid receptor）轉(zhuǎn)錄活性(Kino et al., 2010)，microRNA緩沖海綿等途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖(Zhao et al., 2018)，是廣泛的抑癌分子(Yu and Li, 2015)。但是這些研究都無法完全解釋GAS5的糖敏感性亞細(xì)胞空間動(dòng)態(tài)行為及其對(duì)線粒體代謝的調(diào)控功能。作者通過生物素標(biāo)記的RNA-pulldown聯(lián)合蛋白質(zhì)譜分析，鑒定了GAS5直接靶向作用的線粒體蛋白MDH2（Malate dehydrogenase, mitochondrial）。MDH2是線粒體TCA循環(huán)中維持能量代謝穩(wěn)態(tài)循環(huán)的節(jié)點(diǎn)分子，研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MDH2與其上下游FH、CS可以偶聯(lián)形成代謝區(qū)室，通過反應(yīng)底物串聯(lián)幫助MDH2在細(xì)胞內(nèi)完成逆標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能（ΔG0’）反應(yīng)。敲低GAS5會(huì)增強(qiáng)MDH2代謝區(qū)室穩(wěn)定，并削弱該代謝區(qū)室對(duì)糖的敏感性；而過表達(dá)GAS5則可以模擬糖匱乏信號(hào)，抑制FH-MDH2-CS代謝區(qū)室的形成，并造成檸檬酸、蘋果酸水平異常，線粒體能量代謝失調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。線粒體內(nèi)往往具有很高的乙酰輔酶A濃度，諸多線粒體代謝相關(guān)蛋白受乙?；揎椪{(diào)控(Wagner and Payne, 2013)。通過對(duì)MDH2-K185/301/307/314四個(gè)乙?；稽c(diǎn)的4KR突變，作者發(fā)現(xiàn)MDH2乙?；揎棇?duì)FH-MDH2-CS代謝區(qū)室穩(wěn)定具有中樞作用。GAS5通過動(dòng)態(tài)線粒體轉(zhuǎn)位，可以響應(yīng)并傳遞葡萄糖匱乏信號(hào)，促進(jìn)MDH2募集SIRT3并下調(diào)MDH2乙?；揎?，抑制MDH2與FH/CS互作形成區(qū)室，從而下調(diào)TCA循環(huán)代謝流，抑制線粒體代謝。
代謝重排是腫瘤進(jìn)展重要驅(qū)動(dòng)因子，線粒體代謝提供了大量生物合成的物質(zhì)原料，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。研究者發(fā)現(xiàn)GAS5在乳腺癌中低表達(dá)且與腫瘤良好預(yù)后正相關(guān)，而MDH2、CS、FH在腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)。過表達(dá)GAS5顯著抑制腫瘤中FH-MDH2-CS代謝區(qū)室形成，TCA循環(huán)及腫瘤增殖，從而證實(shí)了線粒體TCA循環(huán)對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要支持作用，而腫瘤低表達(dá)GAS5幫助腫瘤細(xì)胞規(guī)避了能源物質(zhì)缺乏條件下的線粒體代謝抑制效應(yīng)，促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。
?圖 2 LncRNA亞細(xì)胞分布及線粒體GAS5的機(jī)制示意圖
總的來說，本研究通過建立細(xì)胞器免疫親和純化體系，繪制了細(xì)胞器lncRNA圖譜，并從中揭示了線粒體lncRNA GAS5對(duì)TCA循環(huán)MDH2代謝區(qū)室的重要調(diào)節(jié)功能，為線粒體代謝支持腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了新的證據(jù)，為腫瘤臨床診斷提供了新的潛在分子靶標(biāo)GAS5。
浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林愛福研究員為該論文的通訊作者。浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生桑凌杰、楊作臻及中山大學(xué)腫瘤防治中心鞠懷強(qiáng)副研究員為該論文的共同第一作者；該研究得到國家自然科學(xué)基金委、浙江大學(xué)、癌癥研究院等各機(jī)構(gòu)項(xiàng)目的大力支持。
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原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s42255-020-00325-z
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