他克莫司（FK506）在臨床上用于抑制器官移植后的免疫排斥反應(yīng)以及治療真菌引起的皮膚炎癥，其合成基因簇的產(chǎn)物包括：聚酮合酶（PKS）、非核糖體肽合成酶（NRPS）、烯丙基丙二酸單?；ˋM）合成酶以及其它合成酶和調(diào)控因子。浙江大學(xué)與杭州華東醫(yī)藥集團合作，以FK506工業(yè)菌株筑波鏈霉菌為研究對象，從PKS和NRPS的輔基化、AM的轉(zhuǎn)移機制、合成基因簇的調(diào)控三方面研究了FK506的生物合成途徑，并構(gòu)建了高產(chǎn)基因工程菌株。
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磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（PPTase）催化PKS中?；d體蛋白（ACP）和NRPS中肽基載體蛋白（PCP）從脫輔基形態(tài)變成全輔基形態(tài)，筑波鏈霉菌含有5個獨立的PPTase（FKPPT1、FKPPT2、FKPPT3、FKPPT4和FKACPS），是已知物種中含有獨立PPTase數(shù)量最多的，研究結(jié)果表明：在體外它們對FK506合成酶中的ACP和PCP都具有催化活性；在體內(nèi)敲除任何一個PPTase基因都不會消除FK506的產(chǎn)量，表明它們對FK506合成酶的功能具有互補性；在體內(nèi)高表達FKPPT3可以將FK506的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高約20%，并且將發(fā)酵時間縮短約24小時。該研究結(jié)果發(fā)表于Scientific Reports，王月月博士和張小晟碩士為并列第一作者，江輝老師為通訊作者，藥學(xué)院李永泉教授參與指導(dǎo)。http://www.nature.com/articles/srep24255
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AM是FK506分子中特有的酰基合成砌塊，曾有文獻認(rèn)為AM的轉(zhuǎn)移機制與其它酰基類似，是從輔酶A上轉(zhuǎn)移到PKS上的。我們對催化AM轉(zhuǎn)移的酰基轉(zhuǎn)移酶AT4進行了體外表征，發(fā)現(xiàn)AM是從一個ACP上直接轉(zhuǎn)移到PKS上的；AT4在自?；襟E中對底物選擇性比較廣泛，可以轉(zhuǎn)移AM、乙基丙二酸單?；?/span>EM）、甲基丙二酸單?；∕M）但不能轉(zhuǎn)移丙二酸單?；∕）；而在轉(zhuǎn)酰基步驟中AT4的底物選擇性比較嚴(yán)格，只能轉(zhuǎn)移AM和EM，這也解釋了FK506合成酶不僅可以合成FK506還可以合成FK520。該研究結(jié)果發(fā)表于FEBS Journal，江輝老師和王月月博士為并列第一作者，李永泉教授為通訊作者。http://onlinelibrary.wiley.com/wol1/doi/10.1111/febs.13296/abstract
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FK506合成基因簇含3個途徑特異性調(diào)控基因（fkbN、tcs7和tcs2），研究結(jié)果表明：FkbN直接正調(diào)控FK506合成基因的轉(zhuǎn)錄；Tcs7直接正調(diào)控fkbN的轉(zhuǎn)錄從而間接正調(diào)控他克莫司合成基因的轉(zhuǎn)錄；Tcs2對合成基因的轉(zhuǎn)錄無明顯影響；基于以上結(jié)果，我們構(gòu)建了fkbN/tcs7高表達株，其FK506的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了約90%。該研究結(jié)果發(fā)表于J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，張小晟碩士和駱紅豆同學(xué)為并列第一作者，江輝老師和李永泉教授為通訊作者。? http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10295-016-1849-0
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