王宏偉研究組在《細(xì)胞》雜志發(fā)表論文 報(bào)道人源Dicer與Dicer-pre-miRNA復(fù)合體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
清華新聞網(wǎng)4月27日電 4月26日，清華大學(xué)生命學(xué)院、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心王宏偉教授研究組在《細(xì)胞》（Cell）期刊發(fā)表了題為《人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白與Dicer-pre-miRNA復(fù)合體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)》（Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate）的研究論文，首次報(bào)道了人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白的全長(zhǎng)高分辨率結(jié)構(gòu)，同時(shí)還報(bào)道了人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白結(jié)合一種小RNA前體pre-let-7底物的兩種不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)。
RNA干擾（RNAi, RNA interference）是敲低一個(gè)基因表達(dá)的最為常用的一種手段。內(nèi)源性引起RNA干擾的小RNA主要是微小RNA （miRNA）。 到目前為止，人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多達(dá)1800種微小RNA，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等行為與微小RNA的異常表達(dá)密切相關(guān)。
人體內(nèi)絕大部分微小RNA成熟形成都離不開一種核酸內(nèi)切酶，我們稱之為Dicer的蛋白。有趣的是人體內(nèi)只有一個(gè)拷貝的核酸內(nèi)切酶Dicer基因,表達(dá)唯一的一種人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白，然而卻負(fù)責(zé)人體內(nèi)絕大部分微小RNA的形成。因此，核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白在人體細(xì)胞中的重要性不言而喻。核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白是一種只切割雙鏈RNA底物的內(nèi)切酶，分子量大小約為220 kDa，有多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。其中有的結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合RNA底物，有些結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割RNA底物，還有些結(jié)構(gòu)域就像一把尺子，精確測(cè)量出RNA需要被切割的位置。人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)眾多不同的微小RNA前體底物，然后加工生成具有共同特征的長(zhǎng)度約為22堿基和3＇末端有兩個(gè)游離堿基的成熟小RNA。
遺憾的是,人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白的整體三維結(jié)構(gòu)一直沒有得到解析， 人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白是如何精確加工這些微小RNA前體的機(jī)制至今仍然不清晰。人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白一直沒有獲得高分辨率三維結(jié)構(gòu)的主要原因有幾點(diǎn)：1、人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白約為220 kDa，對(duì)于運(yùn)用晶體學(xué)來獲得三維結(jié)構(gòu)來說，分子量比較大，很難結(jié)晶；2、對(duì)于運(yùn)用單顆粒重構(gòu)的方法來獲得高分辨率三維結(jié)構(gòu)來說，其分子量又相對(duì)較?。?、核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白三維結(jié)構(gòu)呈L型，沒有對(duì)稱性，在冰中分布多為長(zhǎng)條型，襯度低，分布不均勻，有優(yōu)勢(shì)取向，對(duì)單顆粒三維重構(gòu)形成了很大的技術(shù)障礙。
過去十年的時(shí)間里，王宏偉以及其他課題組都嘗試運(yùn)用單顆粒電鏡的方法去解析人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白的三維結(jié)構(gòu)。經(jīng)過不斷地摸索，研究組解決了蛋白質(zhì)樣本準(zhǔn)備、冷凍樣本制備、數(shù)據(jù)收集及處理等多方面的技術(shù)難題，最終采用從哺乳動(dòng)物293F細(xì)胞系中共表達(dá)蛋白復(fù)合體，親和層析分離純化蛋白質(zhì)，采用純金或者鍍金載網(wǎng)制備出了分布較為均一、優(yōu)勢(shì)取向相對(duì)較少的冷凍電鏡樣品，并獲得獲得了人源Dicer及其輔因子蛋白TRBP復(fù)合體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)（4.4 埃）（圖1），首次解析了人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白的高分辨率整體結(jié)構(gòu)，看到了核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白中各結(jié)構(gòu)域的精確三維分布及結(jié)構(gòu)域之間的空間關(guān)系。
圖1. 冷凍電鏡解析獲得的人源Dicer-TRBP復(fù)合體(TRBP 是一種RNA結(jié)合蛋白)高分辨率結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域分布
為了更進(jìn)一步了解人源核酸內(nèi)切酶Dicer蛋白是怎樣加工微小RNA前體的過程，王宏偉研究組通過體外重組的方法獲得了人源Dicer-TRBP復(fù)合體與一種微小RNA的前體 pre-let-7所形成的三元復(fù)合體，并解析了該復(fù)合體的兩種三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)。一種是pre-let-7的莖部呈完全互補(bǔ)結(jié)構(gòu)（hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class I），另一種是pre-let-7的莖部呈部分解離的狀態(tài)（hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class II）（圖2）。王宏偉研究組與清華大學(xué)張強(qiáng)鋒研究組合作，通過化學(xué)修飾測(cè)序（icSHAPE）、核糖核酸酶酶切、測(cè)序膠電泳等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)pre-let-7在溶液中呈動(dòng)態(tài)的構(gòu)象平衡，一部分pre-let-7的莖部是完全配對(duì)的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，也有一部分pre-let-7的莖部是呈部分解離的狀態(tài)。深入的研究表明人源Dicer蛋白與TRBP形成的復(fù)合體與pre-let-7結(jié)合可以促進(jìn)該RNA向莖部完全配對(duì)的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，確保其莖部在被Dicer蛋白切割前的構(gòu)象均一性，從而保證微小RNA產(chǎn)物的精確長(zhǎng)度。正是這個(gè)機(jī)制有可能保證了人源Dicer蛋白精確地將眾多結(jié)構(gòu)特征不同的微小RNA前體切割成具有共同的22nt長(zhǎng)度的產(chǎn)物。這項(xiàng)工作為進(jìn)一步解析微小RNA的成熟機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
圖2. 兩種hDicer-TRBP-pre-let-7復(fù)合體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
在本工作中，王宏偉研究組成員，清華大學(xué)生命學(xué)院博士后劉忠民、王家、2015級(jí)博士生程航、2015級(jí)博士生柯鑫為共同第一作者，王宏偉教授為本文的通訊作者。另外，清華大學(xué)生命學(xué)院張強(qiáng)鋒教授，2013級(jí)孫磊博士開展了icSHAPE的實(shí)驗(yàn)，為本工作提供了重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究獲得了清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、高性能計(jì)算平臺(tái)和蛋白質(zhì)分離純化與鑒定平臺(tái)的支持，數(shù)據(jù)處理在國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)（北京）設(shè)施清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)上進(jìn)行。
本工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部、北京市科委、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心和北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心等的大力支持。
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https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.080
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