2018年2月5日，《自然-神經(jīng)科學》（Nature Neuroscience）以Technical Reports的形式在線發(fā)表了由生命學院姚駿課題組和中科院北京基因組所米雙利課題組合作完成的題為CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain的研究論文，報道了他們建立的在動物腦內(nèi)進行基于CRISPR interference (CRISPRi)的多重基因條件性敲低平臺，為在體研究復雜蛋白復合物的功能和多基因神經(jīng)疾病的發(fā)病機理提供了重要的工具。
基因特異性的失活策略是神經(jīng)生物學研究的重要方法，對于闡釋基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的基本生物學功能不可或缺。隨著神經(jīng)科學的高速發(fā)展，單一基因的敲除/敲低逐漸不足以滿足研究者的要求。尤其是對于復雜的多蛋白復合物和多基因神經(jīng)疾病，多重基因元素失活的條件性組合搭配正日益成為主流需求。然而，逐一構(gòu)建不同基因的敲除/敲入動物模型再進行雜交，一直受限于低下的制備效率、冗長的制作周期和昂貴的成本費用，成為了實際研究中的主要瓶頸之一。因此，快捷簡單地操作大腦中的基因表達的方法亟需建立。
CRISPR/Cas9基因編輯工具已被廣泛用于建立轉(zhuǎn)基因細胞株和動物模型。然而，該技術(shù)目前在神經(jīng)科學中的應用還很局限。一方面，神經(jīng)元的不可分裂的特性決定了無法以建立細胞系的方式來研究特定基因在神經(jīng)元中的功能。另一方面，CRISPR/Cas9切割后產(chǎn)生的非同源末端連接修復常常導致非特異性的刪除、插入或其它突變，導致在單細胞水平產(chǎn)生多種表型變化，例如雜合型、純合失活型和野生型等，將可能對后續(xù)實驗產(chǎn)生不必要但卻可能是非常嚴重的干擾。
在這項研究中，作者利用病毒傳遞策略，針對神經(jīng)元構(gòu)建了優(yōu)化的基于dCas9的CRISPRi系統(tǒng)，達到在小鼠腦內(nèi)進行高效且靶向特異性的抑制功能基因表達的目的。該系統(tǒng)不但在單細胞水平獲得均一的表型，而且在基因沉默水平上顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)。利用sgRNA相隔錯配的“釣魚”策略，作者進一步證明基于dCas9的CRISPRi技術(shù)在神經(jīng)元中具有精確的靶向特異性，幾乎不會產(chǎn)生脫靶效應。因而，針對神經(jīng)元特異的CRISPRi技術(shù)可用于快速地構(gòu)建腦內(nèi)基因特異性敲低的動物模型，能夠大大縮短了研究時間和花費。
作者進一步拓展該技術(shù)在動物腦內(nèi)的應用，利用神經(jīng)元亞群特異性的啟動子條件性控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經(jīng)元中的獨立失活，以達到雙向調(diào)節(jié)局部神經(jīng)網(wǎng)絡的興奮/抑制平衡的目的。分子生物學和電生理學實驗證明，條件性CRISPRi能精確控制Syt1基因在特定類型神經(jīng)元中喪失功能而不影響Syt1在其它類型細胞中的表達。進一步的動物行為學測試表明，上調(diào)或下調(diào)齒狀回神經(jīng)網(wǎng)絡的興奮/抑制平衡，使得小鼠學習記憶能力出現(xiàn)相應的雙向變化；然而，無論是平衡朝哪個方向移動，小鼠均表現(xiàn)出抑郁和焦慮行為。這些基于條件性CRISPRi的實驗結(jié)果表明，海馬區(qū)對于動物學習記憶和精神活動的調(diào)節(jié)具有完全不同的機制。最后，作者建立了靶向Syt1及其互作蛋白網(wǎng)絡的基因Syb2,Stx1a/b和SNAP25a的五重基因CRISPRi。這一測試采用兩種不同的策略，分別是：1）多種聚合酶III型啟動子獨立驅(qū)動的sgRNA表達框和dCas9-KRAB共表達的一體化載體系統(tǒng)；2）串聯(lián)表達的同種聚合酶III型啟動子驅(qū)動sgRNA表達框與dCas9-KRAB獨立表達的雙載體系統(tǒng)。實驗證明，這兩套系統(tǒng)都能夠在小鼠腦內(nèi)實現(xiàn)靈活多變的多基因不同組合的高效失活。因此，針對神經(jīng)元的CRISPRi能夠靈活地實現(xiàn)小鼠腦中復雜基因網(wǎng)絡的條件性調(diào)節(jié)。
本文作者的一系列實驗證明，基于病毒傳遞策略的CRISPRi工具，能夠在動物出生后的各個階段，包括在生理及病理狀態(tài)下實現(xiàn)在體操作，建立神經(jīng)元和動物模型，從分子到細胞，從環(huán)路到行為，解析多重基因和復雜表型之間的關(guān)聯(lián)，探索復雜腦疾病的致病機制，并在此基礎上尋求新型有效的治療策略。因而，該研究工作為神經(jīng)生物學研究提供了靈活而多樣的基因操作工具。
清華大學生命學院姚駿研究員和中科院北京基因組所米雙利研究員為本文共同通訊作者，生命學院博士后鄭毅和沈偉為本文共同第一作者，中科院北京基因組所張健和清華生命學院劉要南等博士生為本工作做出重要貢獻。本研究得到了清華大學鐘毅教授和時松海教授、美國Salk研究所Fred Gage教授和Patrick Hsu教授的大力協(xié)助。本工作獲得了膜生物學國家重點實驗室、科技部重點研發(fā)專項、國家自然科學基金以及生命科學聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。
原文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41593-018-0077-5
圖1. CRISPRi在小鼠腦內(nèi)進行條件性敲低和多重敲低的設計示意圖。
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