清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院杜亞楠課題組在Nature Communications發(fā)文報(bào)道精確調(diào)控細(xì)胞在3D多孔生物材料支架中機(jī)械響應(yīng)的新方法
2019年 8月2 日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心杜亞楠研究組于Nature Communications 《自然•通訊》在線發(fā)表了題為“Cryoprotectant enables structural control of porous scaffolds for exploration of cellular mechano-responsiveness in 3D”的研究論文。該研究首次利用冰凍保護(hù)劑，對(duì)3D多孔生物支架材料的孔徑和硬度實(shí)現(xiàn)了獨(dú)立和精確的調(diào)控，并系統(tǒng)探究了成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)于材料孔徑和硬度的機(jī)械響應(yīng)特征和相關(guān)機(jī)制，為基于仿生3D多孔支架材料中的生物力學(xué)和組織工程研究提供了有力工具，為精確控制細(xì)胞3D微環(huán)境的物理特性提供了理論和實(shí)施基礎(chǔ)。
近年來(lái)生物力學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展已證明生物基質(zhì)材料的物理特性（如硬度）是構(gòu)成細(xì)胞微環(huán)境的重要特性，對(duì)細(xì)胞表型和功能（如粘附、增殖、遷移、分化、遺傳和表觀遺傳等）的調(diào)控至關(guān)重要。目前對(duì)于生物材料的生物力學(xué)研究局限于2D平面材料或僅具有納米孔的3D水凝膠，盡管3D大孔生物支架材料在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用，至今尚未能對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)性的生物力學(xué)研究，這是由于大孔支架材料最主要的兩個(gè)物理特性即支架的孔徑和硬度通常相互關(guān)聯(lián)，目前的制備手段（如靜電紡絲、冷凍干燥、致孔劑）很難對(duì)兩者進(jìn)行獨(dú)立調(diào)控以實(shí)現(xiàn)單一生物力學(xué)特性調(diào)控細(xì)胞行為的深入研究。
本研究中，杜亞楠教授課題組發(fā)現(xiàn)引入冰凍保護(hù)劑（如DMSO、甘油、甲醇）可對(duì)冰晶生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)有效調(diào)控，并利用這一特性實(shí)現(xiàn)了對(duì)于多孔支架材料孔徑與硬度的獨(dú)立調(diào)控。研究者發(fā)現(xiàn)，在冷凍過(guò)程中，隨著冰晶生長(zhǎng)，反應(yīng)液相中的DMSO被不斷濃縮，導(dǎo)致液相凝固點(diǎn)逐漸降低最終致使冰晶停止生長(zhǎng)。理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，最初反應(yīng)液中的DMSO濃度可決定最終形成冰晶的大小?；诖嗽?，通過(guò)調(diào)控交聯(lián)劑和冰凍保護(hù)劑的用量，可制備出源自各類原料組分（如明膠，透明質(zhì)酸/明膠復(fù)合材料），孔徑范圍在20-80 μm，微觀硬度范圍在20-190kPa的可獨(dú)立、精確調(diào)控孔徑和硬度的3D多孔支架材料。
圖1：使用冰凍保護(hù)劑控制冰晶生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)硬度和孔徑的獨(dú)立、精確調(diào)控
本研究開發(fā)的此種簡(jiǎn)單易行的多孔支架制備方法，使得系統(tǒng)研究材料結(jié)構(gòu)和硬度對(duì)細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)成為了可能。成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是在生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用的兩類細(xì)胞，其對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)生物力學(xué)性質(zhì)的響應(yīng)對(duì)于病理研究及植入材料設(shè)計(jì)都具有重要意義。體外研究發(fā)現(xiàn)，人真皮成纖維細(xì)胞在大孔徑-較高硬度（80μm, 190 kPa）的材料中呈現(xiàn)出更激活的狀態(tài)（例如：高表達(dá)αSMA），且材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子YAP的定位來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)。巨噬細(xì)胞通?？蓸O化為促炎癥反應(yīng)的M1型細(xì)胞和促損傷修復(fù)的M2型細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞在小孔徑-較低硬度 (30 μm, 20 kPa)的材料中，傾向于極化為M1表型。相反，在大孔徑-高硬度材料中，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型特征。相應(yīng)的，在小鼠體內(nèi)皮下植入試驗(yàn)中，植入小孔徑-低硬度材料，會(huì)誘導(dǎo)更多炎性細(xì)胞如M1型巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)出顯著的促炎效果；在小鼠體內(nèi)皮膚修復(fù)模型中，植入大孔徑-高硬度材料對(duì)于皮膚修復(fù)愈合速度和纖維化的促進(jìn)作用最明顯，表明對(duì)于損傷修復(fù)的促進(jìn)效果。
圖2：a.體外試驗(yàn)巨噬細(xì)胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型。b.體內(nèi)皮膚損傷修復(fù)模型中，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了多孔支架材料孔徑對(duì)細(xì)胞表型調(diào)控的潛在機(jī)制。發(fā)現(xiàn)可通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)液滲透壓大小模擬不同孔徑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的空間物理限制。在高滲環(huán)境下，普通2D培養(yǎng)和3D大孔徑培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都呈現(xiàn)出在3D小孔材料中的表型。表明材料孔徑對(duì)細(xì)胞的機(jī)械調(diào)控和由孔徑產(chǎn)生的物理限制 (physical confinement）有關(guān)。
本研究首次使用冰凍保護(hù)劑調(diào)控冰晶生長(zhǎng)，從而在多孔生物支架材料中實(shí)現(xiàn)了孔徑和硬度的獨(dú)立、精確調(diào)節(jié)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了多孔支架孔徑和硬度對(duì)于細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)的調(diào)控。以上研究結(jié)果為3D多孔生物支架材料的生物力學(xué)研究提供了有效平臺(tái)，同時(shí)對(duì)調(diào)控3D細(xì)胞微環(huán)境的物理特性和對(duì)于其在組織工程領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用提供了新的設(shè)計(jì)思路。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心杜亞楠研究員為本論文的通訊作者，杜亞楠研究組碩士研究生蔣書萌、博士研究生呂丞為本文共同第一作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院石彥教授，夏鐵副研究員在原子力顯微鏡力學(xué)表征方面提供了技術(shù)支持。美國(guó)華盛頓-圣路易斯大學(xué)機(jī)械工程系的Guy Genin教授在生物力學(xué)理論方面給與了支持，北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院皮膚科黃晨昱醫(yī)師在皮膚修復(fù)方面給與了支持。該研究得到了清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、生物醫(yī)學(xué)測(cè)試中心的支持。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資金資助。
文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-019-11397-1
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