清華大學醫(yī)學院郭永實驗室合作在《Analyst》報道數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的準確、可靠、非監(jiān)督自動分類新方法
2019年8月5日，清華大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系郭永實驗室在《分析學家》（Analyst）在線以封底（back cover）發(fā)表題為《一種雙熒光四分類微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的準確、可靠和自動分類方法——密度分水嶺算法》（A density-watershed algorithm (DWA) method for robust, accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data）的研究論文，該研究將微液滴數(shù)字PCR的數(shù)據(jù)密度分布與分水嶺算法（一種圖像分割方法）有機結合，建立了一種微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)非監(jiān)督分類的新方法。
微液滴數(shù)字PCR是一種單分子水平的核酸定量分析技術。通過將PCR反應體系分割為大量的微液滴，絕大多數(shù)微液滴內僅含有0個或1個模板分子，含有模板分子的微液滴在PCR擴增后呈現(xiàn)出較強的熒光信號。通過微液滴內熒光的檢測，可以得到微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)。依據(jù)熒光強度對該數(shù)據(jù)進行分類，即可判斷出含有模板分子的微液滴的數(shù)量和比例，最終通過泊松分布統(tǒng)計學計算，得到模板分子的絕對拷貝數(shù)。在上述過程中，微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的分類是關鍵步驟，它直接影響到統(tǒng)計學計算的輸入，因而決定著微液滴數(shù)字PCR定量結果的準確性。目前，微液滴數(shù)字PCR的數(shù)據(jù)分類方法主要有兩種：一種是針對每種反應定制的監(jiān)督分類算法，這些算法具有較高的準確性，但是針對不同的樣本類型和檢測指標，需要開發(fā)多種不同的分類算法；另一種是通用的非監(jiān)督分類算法，但是它們的準確性和可靠性都不盡如人意，且時常會出現(xiàn)假陰性和假陽性的檢測結果。
為了解決上述不足，研究人員模擬人眼對微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的分類過程，將微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)作為一幅圖像，提出了一種新型的數(shù)據(jù)分類方法——密度分水嶺算法。該方法通過數(shù)據(jù)密度分布的判斷，使用分水嶺算法自動地、非監(jiān)督地將網格化（圖像化）的微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)沿著數(shù)據(jù)相對稀疏的位置分割為若干區(qū)域，最后通過這些區(qū)域的邊界實現(xiàn)準確、可靠、自動的非監(jiān)督數(shù)據(jù)分類（圖1）。研究人員將密度分水嶺算法與現(xiàn)有主流商業(yè)化算法進行了比較，在人類表皮生長因子受體（EGFR）的L858R和T790M突變位點的檢測方面，密度分水嶺算法實現(xiàn)的檢測限是現(xiàn)有主流商業(yè)化算法的1/40，顯著地提高了微液滴數(shù)字PCR自動化檢驗的檢測能力。研究人員進一步使用Bio-Rad QX200和新羿TD-1兩種微液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，在254例冰凍組織、石蠟包埋組織和外周血臨床樣本上驗證了密度分水嶺算法，其中絕大部分（>84%）臨床樣本的定量結果優(yōu)于現(xiàn)有主流商業(yè)化算法，且全部臨床樣本未出現(xiàn)假陰性和假陽性的檢測結果。
圖1. 密度分水嶺算法實現(xiàn)微液滴數(shù)字PCR數(shù)據(jù)自動分類的原理及Analyst雜志封底
該研究為微液滴數(shù)字PCR的臨床應用提供了一種新的自動化數(shù)據(jù)分析思路，有望用于臨床的全自動核酸絕對定量。隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，開發(fā)準確、可靠、全自動的單拷貝核酸定量分析方法對于疾病的篩查、診斷、用藥指導、病情監(jiān)測和預后均具有重要意義。
清華大學醫(yī)學院的朱修銳博士為該論文的第一作者，醫(yī)學院郭永研究員和精儀系荊高山博士對該研究進行了指導，北京新羿生物科技有限公司參與了合作研究。本課題得到國家自然科學基金和北京新羿生物科技有限公司橫向合作課題等經費資助。
◎論文鏈接：https://doi.org/10.1039/C9AN00637K
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