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北京大學(xué)陳雷研究組報(bào)道人源DUOX1復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)

ROS（活性氧）是化學(xué)反應(yīng)活性很高，并且以氧元素為主的一系列化合物，包括過氧化氫、超氧陰離子等，它們參與眾多生物學(xué)過程，同時(shí)也是一種重要的信號(hào)分子[1]。在生物體內(nèi)，有很多氧化還原反應(yīng)可以作為副產(chǎn)物產(chǎn)生ROS，比如線粒體呼吸鏈和P450氧化還原酶等。除此之外，還有一種專門產(chǎn)生ROS的酶即NADPH氧化酶（NOX），能夠受細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程的調(diào)控來產(chǎn)生ROS。人源NOX蛋白家族成員包括NOX1-5和DUOX1-2 [2]。NOX參與了宿主防御、分化、發(fā)育、細(xì)胞生長和存活、細(xì)胞骨架的再重建等一系列重要的生物學(xué)過程[2], [3]。DUOX1-2在甲狀腺中高表達(dá)，它們能夠催化氧氣的還原，產(chǎn)生過氧化氫，進(jìn)一步促進(jìn)甲狀腺激素的合成[4]。DUOX功能缺失性突變會(huì)導(dǎo)致先天性甲狀腺功能減低癥[5]。

NOX家族蛋白是膜整合蛋白，它們都有一個(gè)相似的核心模塊，負(fù)責(zé)催化氧化還原反應(yīng)，該模塊由雙血紅素分子結(jié)合的跨膜區(qū)（TMD）和胞內(nèi)的脫氫酶結(jié)構(gòu)域組成[6]。而除催化核心模塊外，DUOX蛋白還有一個(gè)過氧化物酶同源結(jié)構(gòu)域PHD和兩個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域。此外，DUOX蛋白還需要DUOXA1輔助亞基來形成有功能的復(fù)合物[7]。據(jù)研究報(bào)道DUOX的活力受到體內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)控，鈣離子可以直接結(jié)合在DUOX上，提高DUOX的酶活力[4]。盡管DUOX和其它NOX家族蛋白有著極其重要的功能，但DUOX復(fù)合體的組裝以及鈣激活的分子機(jī)制仍不清楚。

2021年1月8日，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)所，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳雷研究組在Nature Communications雜志上報(bào)導(dǎo)了人源DUOX1復(fù)合體在高鈣和低鈣狀態(tài)下的兩個(gè)高分辨結(jié)構(gòu)。文章鏈接: https://www.doi.org/10.1038/s41467-020-20466-9

作者們首先通過凝膠過濾層析法確定人源DUOX1-DUOXA1可以形成穩(wěn)定的異源四聚體復(fù)合物，然后通過體外活力測定的方法發(fā)現(xiàn)：在低鈣條件下，DUOX1復(fù)合物顯示了低的基礎(chǔ)活力，鈣離子的加入不僅能夠提高DUOX復(fù)合物與底物NADPH的結(jié)合親和力，還能提高DUOX1復(fù)合物的催化效率，從而增強(qiáng)了酶的活力。接著，作者們將純化好的DUOX1復(fù)合物重構(gòu)到peptidisc中，制備了高鈣和低鈣狀態(tài)下DUOX1復(fù)合物的冷凍電鏡樣品。在克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難后，通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了2.6?和2.7?高分辨率的DUOX1復(fù)合體的電子密度并搭建了原子模型。

結(jié)構(gòu)顯示兩個(gè)DUOX1亞基和兩個(gè)DUOXA1亞基共同組裝成一個(gè)2:2的異源四聚體復(fù)合物（圖1）。整個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)分為三個(gè)部分：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。在胞外區(qū)，位于對角線上的兩個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域具有相互作用，同時(shí)DUOXA1的胞外區(qū)域從底部協(xié)助胞外區(qū)的排列；其跨膜區(qū)由24根跨膜螺旋組成，結(jié)合兩對血紅素，能使電子穿過細(xì)胞膜；其胞內(nèi)區(qū)由起催化作用的脫氫酶結(jié)構(gòu)域DH和感應(yīng)鈣離子的EF-hand等結(jié)構(gòu)域組成。

圖1：人源DUOX1-DUOXA1復(fù)合體在高鈣狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)

作者測量了在高鈣狀態(tài)下DUOX1結(jié)構(gòu)中負(fù)責(zé)電子傳遞的各分子邊緣距離，發(fā)現(xiàn)NADPH-FAD-內(nèi)血紅素-外血紅素間的距離分別是8.2?、3.9?和6.7?。盡管可能還有其它額外的DUOX1氨基酸殘基參與了電子傳遞，NADPH-FAD的距離卻是大于經(jīng)典的FNR同源蛋白[8]。通過結(jié)構(gòu)比較，作者發(fā)現(xiàn)與FNR以及csNOX5的DH相比，DUOX1的催化脫氫酶DH處于一個(gè)松弛的構(gòu)象，因此在現(xiàn)有的DUOX1結(jié)構(gòu)中，電子傳遞途徑并非最優(yōu)的狀態(tài)。作者發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞膜上的DUOX1比純化組裝在peptidisc中的樣品具有更高的活力，因此推測細(xì)胞膜上的磷脂或者脂雙層環(huán)境可能以某種未知的方式影響DUOX1的結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)其電子傳遞效應(yīng)。

單顆粒重構(gòu)算法Multibody修正所提供的柔性分析顯示在低鈣狀態(tài)下胞內(nèi)區(qū)域顯示了寬的梯形分布，這與在高鈣狀態(tài)下的近似正態(tài)分布形成了鮮明對比。這表明在低鈣狀態(tài)下胞內(nèi)區(qū)具有更大的不穩(wěn)定性。作者比較了高鈣和低鈣兩個(gè)狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鈣引起的構(gòu)象變化主要發(fā)生在胞內(nèi)區(qū)的調(diào)控結(jié)構(gòu)域：在低鈣條件下，EF-hand調(diào)控元件呈延伸的形狀；EF2遠(yuǎn)離催化DH結(jié)構(gòu)域；PHLD遠(yuǎn)離TMD和DH結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)改變使得DH與TMD的相互作用變?nèi)酰M(jìn)而導(dǎo)致DH處于更靈活的狀態(tài)。作者推測DH的高靈活性降低了電子傳遞的有效性和NADPH的親和力，進(jìn)而降低了DUOX的催化活力。

圖2：DUOX1的電子傳遞途徑以及可能的鈣激活機(jī)制

綜上所述，本項(xiàng)研究解析了在高鈣和低鈣兩種狀態(tài)下人源DUOX1-DUOXA1在peptidisc中穩(wěn)定的異源四聚體復(fù)合物的高分辨結(jié)構(gòu)，觀測到了高鈣狀態(tài)下DUOX1多個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域間的相互作用以及不同鈣離子濃度下胞內(nèi)調(diào)控結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，為深入理解DUOX以及其他NOX家族蛋白酶的結(jié)構(gòu)以及活力調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本項(xiàng)研究主要由北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)所博士后吳驚香完成，博士生劉銳和宋康成參與了部分實(shí)驗(yàn)，陳雷研究員為通訊作者。本工作獲得科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委、生命科學(xué)聯(lián)合中心等經(jīng)費(fèi)支持。博士后吳驚香獲得了CLS博士后獎(jiǎng)學(xué)金、北京大學(xué)博雅博士后獎(jiǎng)學(xué)金、國家自然科學(xué)基金及中國博士后科學(xué)基金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)和北京大學(xué)電鏡室完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項(xiàng)目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)CLS計(jì)算平臺(tái)及未名超算平臺(tái)的硬件和技術(shù)支持。

北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)所陳雷實(shí)驗(yàn)室主要研究膜蛋白特別是與代謝類疾病和心血管疾病相關(guān)的重要膜蛋白的工作機(jī)制（http://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/34142.htm）。該實(shí)驗(yàn)室開展了對KATP通道[9-11]，TRPC通道[12]，OSCA通道[13]，sGC [14]，SOAT (ACAT) [15]，以及鈉通道NALCN復(fù)合體[16]等重要蛋白質(zhì)的機(jī)制研究。陳雷實(shí)驗(yàn)室長期招聘博士后，希望有生物化學(xué)、電生理、抗體制備或結(jié)構(gòu)生物學(xué)背景的博士加入該實(shí)驗(yàn)室。

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[1]?Sies H, Jones D P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020, 21(7): 363-383.

[2]?Lambeth J D, Neish A S. Nox enzymes and new thinking on reactive oxygen: a double-edged sword revisited. Annu Rev Pathol, 2014, 9(119-145.

[3]?Winterbourn C C, Kettle A J, Hampton M B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annu Rev Biochem, 2016, 85(765-792.

[4]?Ohye H, Sugawara M. Dual oxidase, hydrogen peroxide and thyroid diseases. Exp Biol Med (Maywood), 2010, 235(4): 424-433.

[5]?Weber G, Rabbiosi S, Zamproni I, Fugazzola L. Genetic defects of hydrogen peroxide generation in the thyroid gland. J Endocrinol Invest, 2013, 36(4): 261-266.

[6]?Sumimoto H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J, 2008, 275(13): 3249-3277.

[7]?Grasberger H, Refetoff S. Identification of the maturation factor for dual oxidase. Evolution of an eukaryotic operon equivalent. J Biol Chem, 2006, 281(27): 18269-18272.

[8]?Deng Z, Aliverti A, Zanetti G, Arakaki A K, Ottado J, Orellano E G, Calcaterra N B, Ceccarelli E A, Carrillo N, Karplus P A. A productive NADP+ binding mode of ferredoxin-NADP + reductase revealed by protein engineering and crystallographic studies. Nat Struct Biol, 1999, 6(9): 847-853.

[9]?Li N, Wu J X, Ding D, Cheng J, Gao N, Chen L. Structure of a Pancreatic ATP-Sensitive Potassium Channel. Cell, 2017, 168(1-2): 101-110 e110.

[10]?Wu J X, Ding D, Wang M, Kang Y, Zeng X, Chen L. Ligand binding and conformational changes of SUR1 subunit in pancreatic ATP-sensitive potassium channels. Protein Cell, 2018, 9(6): 553-567.

[11]?Ding D, Wang M, Wu J X, Kang Y, Chen L. The Structural Basis for the Binding of Repaglinide to the Pancreatic KATP Channel. Cell Rep, 2019, 27(6): 1848-1857 e1844.

[12]?Tang Q, Guo W, Zheng L, Wu J X, Liu M, Zhou X, Zhang X, Chen L. Structure of the receptor-activated human TRPC6 and TRPC3 ion channels. Cell Res, 2018,

[13]?Zhang M, Wang D, Kang Y, Wu J X, Yao F, Pan C, Yan Z, Song C, Chen L. Structure of the mechanosensitive OSCA channels. Nat Struct Mol Biol, 2018, 25(9): 850-858.

[14]?Kang Y L, Liu R, Wu J X, Chen L. Structural insights into the mechanism of human soluble guanylate cyclase. Nature, 2019, 574(7777): 206-+.

[15]?Guan C C, Niu Y G, Chen S C, Kang Y, Wu J X, Nishi K, Chang C C Y, Chang T Y, Luo T P, Chen L. Structural insights into the inhibition mechanism of human sterol O-acyltransferase 1 by a competitive inhibitor. Nature Communications, 2020, 11(1):

[16]?Kang Y, Wu J X, Chen L. Structure of voltage-modulated sodium-selective NALCN-FAM155A channel complex. Nat Commun, 2020, 11(1): 6199.

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