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陳雷課題組揭示一氧化氮受體sGC的工作機(jī)制

一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的氣體，也是一種神奇的信號分子。一氧化氮信號通路在調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張、神經(jīng)傳遞、血小板凝集、免疫、細(xì)胞增殖、線粒體呼吸等生理過程中起著至關(guān)重要的作用。1998年Robert F. Furchgott， Louis J. Ignarro?和?Ferid Murad 由于闡明一氧化氮是一種信號分子而被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。以心血管系統(tǒng)為例，上皮細(xì)胞中的一氧化氮合成酶被上游信號激活后會催化生成一氧化氮。一氧化氮自由擴(kuò)散至鄰近的血管平滑肌細(xì)胞中，結(jié)合并激活一氧化氮受體——可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），進(jìn)而催化GTP生成第二信使cGMP。cGMP通過激活下游PKG等效應(yīng)蛋白來發(fā)揮生理功能。作為一氧化氮受體的sGC是利奧西呱（Riociguat，用于治療肺動脈高壓）的作用靶點。此外，硝酸甘油，一種從140年前就應(yīng)用于臨床治療心絞痛的藥物，也是通過釋放一氧化氮來激活sGC而發(fā)揮作用的。

今年是鳥苷酸環(huán)化酶發(fā)現(xiàn)的50周年。1969年，人們首次檢測到鳥苷酸環(huán)化酶的活力，發(fā)現(xiàn)鳥苷酸環(huán)化酶包含兩種形式：膜結(jié)合的鳥苷酸環(huán)化酶和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）；在上個世紀(jì)80年代，幾個研究組分別從組織中純化出sGC；1988 和1990年，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的兩個亞基分別被克隆出來。此后的研究證明：sGC是異源二聚體，由一個α亞基和一個β亞基構(gòu)成。α和β亞基的序列具有同源性，而且結(jié)構(gòu)域排布類似：N端的H-NOX結(jié)構(gòu)域，PAS結(jié)構(gòu)域，CC結(jié)構(gòu)域及催化結(jié)構(gòu)域CD。前期研究表明，β亞基的H-NOX結(jié)構(gòu)域結(jié)合了一個亞鐵血紅素，與NO有高親和力。該亞鐵被氧化成三價鐵后酶的活力會降低。雖然此前結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的零碎數(shù)據(jù)對我們理解sGC的機(jī)制至關(guān)重要，但一氧化氮是如何激活sGC催化活力的仍然是該領(lǐng)域最大的未解之謎。

2019年9月12日，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，生命聯(lián)合中心陳雷課題組在Nature雜志上發(fā)表題目為Structural insights into the mechanism of human soluble guanylate cyclase 的文章，鏈接見：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1584-6。該工作首次解析了人源sGC在無活力狀態(tài)及一氧化氮激活狀態(tài)下的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并結(jié)合突變體活力實驗，提出了sGC的工作機(jī)制。

經(jīng)過同源蛋白篩選等步驟，陳雷研究組確定以人源α1β1亞基組成的sGC蛋白為研究對象。隨后，該研究組制備了四種sGC的冷凍樣品：無配體結(jié)合狀態(tài)；血紅素鐵處于氧化（無活力）狀態(tài)；一氧化氮激活狀態(tài)以及H105C組成型激活突變體。陳雷研究組克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難，通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了上述四種樣品分別在4?，3.9?，3.8?及6.8?分辨率的電子密度，并根據(jù)Multibody修正后的電子密度及同源蛋白結(jié)構(gòu)搭建了其原子模型。

無配體結(jié)合狀態(tài)和血紅素氧化狀態(tài)的sGC結(jié)構(gòu)非常相近，被歸類于無活力狀態(tài)。一氧化氮激活狀態(tài)和H105C組成型激活突變體sGC結(jié)構(gòu)非常相近，被歸類于激活狀態(tài)。在無活力狀態(tài)下，整個分子出于彎曲狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)可以大體分為：H-NOX和PAS結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的感受模塊，CC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的傳導(dǎo)模塊及催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的催化模塊。β1 H105與位于血紅素中央的鐵離子緊密結(jié)合，使β1 H-NOX處于失活構(gòu)象，而α1 H-NOX的血紅素結(jié)合口袋被N端螺旋所占據(jù)，無法結(jié)合血紅素。兩個亞基的H-NOX結(jié)構(gòu)域在空間上由PAS異源二聚體隔開，并不直接接觸。位于整個分子中間的傳導(dǎo)模塊在靠近N端部分有一個近直角的彎曲，這種彎曲的構(gòu)象是由β1 H-NOX與PAS及CC結(jié)構(gòu)域復(fù)雜的相互作用來穩(wěn)定的。在無活力狀態(tài)下，位于C端的催化模塊的底物結(jié)合口袋處于關(guān)閉狀態(tài)，底物無法結(jié)合。二硫鍵交聯(lián)實驗進(jìn)一步驗證了無活力狀態(tài)下所觀測到的結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。

在一氧化氮激活狀態(tài)下，β1 H-NOX的H105 與Heme中鐵離子的相互作用被一氧化氮的結(jié)合破壞，導(dǎo)致β1 H-NOX結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，并且進(jìn)一步導(dǎo)致β1 H-NOX與周圍結(jié)構(gòu)域的相互作用界面發(fā)生變化，最終，sGC處于一種與無活力狀態(tài)差別很大的伸展?fàn)顟B(tài)。此構(gòu)象中，構(gòu)成傳導(dǎo)模塊的CC結(jié)構(gòu)域從無活力狀態(tài)中的直角彎曲螺旋變成了兩根完整的伸展的螺旋，該構(gòu)象變化類似于膝關(guān)節(jié)的彎曲和伸展。CC結(jié)構(gòu)域兩個螺旋之間還發(fā)生了70度的相對轉(zhuǎn)動，導(dǎo)致與CC結(jié)構(gòu)域直接相連的催化模塊的構(gòu)象變化：兩個亞基的催化結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，底物結(jié)合口袋打開，并且在兩個催化結(jié)構(gòu)域之間可以觀察到底物類似物的結(jié)合。

通過比較無活力和激活兩種狀態(tài)的構(gòu)象，我們可以發(fā)現(xiàn)β1 H-NOX的構(gòu)象變化是整個sGC分子結(jié)構(gòu)改變的驅(qū)動力，該構(gòu)象變化通過氨基酸間的相互作用傳遞至整個感受模塊和傳導(dǎo)模塊，最終到達(dá)催化模塊。這些結(jié)構(gòu)上的觀察與本項工作中報道的突變體活力測定結(jié)果相吻合：β1 H-NOX的缺失突變體無法被一氧化氮激活；β1 H-NOX與周圍結(jié)構(gòu)域相互作用界面上的突變體的一氧化氮激活大大減弱；傳導(dǎo)模塊發(fā)生構(gòu)象變化的“關(guān)節(jié)”位置的脯氨酸突變導(dǎo)致一氧化氮無法激活。

綜上所述，本項研究通過強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，觀測到了一氧化氮激活sGC過程中的構(gòu)象變化，為深入理解sGC的工作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本項研究主要由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所博士生康云路和劉銳共同完成，博士后吳驚香參與了部分工作，陳雷研究員為通訊作者。本工作獲得科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委、生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。博士后吳驚香先后獲得了生命科學(xué)聯(lián)合中心博士后獎學(xué)金、北京大學(xué)博雅博士后獎學(xué)金及中國博士后科學(xué)基金的支持。該工作冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等老師的幫助。該項目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)CLS計算平臺及未名超算平臺的硬件和技術(shù)支持。廈門大學(xué)韓家淮教授提供了人源sGC的cDNA，俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)的David B. Morton教授提供了果蠅和鼠源sGC的 cDNA。