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何愛彬研究組開發(fā)高通量單細胞ChIP-seq技術(shù)——CoBATCH并解析多器官內(nèi)皮細胞譜系發(fā)育的表觀與功能異質(zhì)性

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2019年8月27日，北京大學分子醫(yī)學研究所，北京大學-清華大學生命科學聯(lián)合中心研究員何愛彬研究組在《Molecular Cell》雜志在線發(fā)表題為“CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling”的文章，報道了一種新的具有普適性、易操作、高通量和高質(zhì)量的單細胞ChIP-seq技術(shù)，并將其命名為CoBATCH (combinatorial barcoding and targeted chromatin release)。這一單細胞技術(shù)不僅適用于研究各種組蛋白修飾，同時也能捕獲DNA結(jié)合蛋白在基因組上的結(jié)合信息。利用這一單細胞技術(shù)，研究者首次解析了小鼠胚胎10個器官（心臟、肝臟、肺、左腦、右腦、后腦、腎臟、皮膚、肌肉和小腸）的內(nèi)皮細胞譜系發(fā)育、分化和功能的異質(zhì)性。(原文鏈接: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.07.015)。

基因的表達是生物體一切生命活動的基礎，DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體重新定位等表觀遺傳的調(diào)節(jié)對基因表達調(diào)控具有重要作用。這些表觀遺傳修飾的變化往往會導致基因表達的改變，從而進一步對基因組穩(wěn)態(tài)的維持，發(fā)育的時空調(diào)節(jié)，細胞的命運決定等重要的生命過程產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)和DNA相互作用的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) (ChIP-seq) 技術(shù)是研究表觀遺傳調(diào)控的一種重要手段，這項技術(shù)可在全基因組范圍內(nèi)識別順式調(diào)控元件和反式作用因子的互作信息，并能構(gòu)建基因表達調(diào)控網(wǎng)絡，從而加深我們對生命過程調(diào)控機制的理解。

單細胞測序技術(shù)目前被廣泛用于研究發(fā)育與疾病相關(guān)細胞群體異質(zhì)性和繪制細胞圖譜。隨著技術(shù)的發(fā)展，這項技術(shù)正逐漸將生命科學研究推進到新的維度。在單細胞表觀組領域，雖然DNA甲基化測序、染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)、染色質(zhì)開放程度測序已經(jīng)分別在2013年 (scRRBS [1])、2013年 (single cell Hi-C [2])、2015年 (scATAC-seq [3])實現(xiàn)了單細胞水平測序。研究基因表達調(diào)控與細胞命運決定的機制，最直接的證據(jù)是特定染色質(zhì)區(qū)域與蛋白的相互作用，然而，高效的單細胞染色質(zhì)免疫共沉淀測序（scChIP-seq）技術(shù)尚未出現(xiàn)。

常規(guī)ChIP-seq技術(shù)需要使用超聲打斷交聯(lián)的基因組片段，然后用特異性抗體富集含有目的蛋白結(jié)合的基因組片段，并將目的DNA片段純化后，添加接頭進行建庫測序。這一系列操作使得ChIP-seq需要百萬個細胞作為起始材料。為降低ChIP-seq技術(shù)對細胞數(shù)目的要求，近年來，MOWChIP [4]，STAR-ChIP [5] 和ULI-NChIP [6] 等適用于少量細胞起始的ChIP-seq技術(shù)被逐漸開發(fā)出來，但細胞群體的異質(zhì)性，發(fā)育過程中染色質(zhì)狀態(tài)的動態(tài)變化需要在單細胞分辨率進行進一步的研究。雖然Drop-ChIP [7] 第一次實現(xiàn)了單細胞水平ChIP-seq，然而這一技術(shù)依賴特殊的微流控裝置，并且每個細胞只能捕獲到約800個DNA片段，這極大地限制了這項技術(shù)的推廣應用。隨后開發(fā)的scChIC-seq [8] 雖然實現(xiàn)了單細胞水平的解析，但是獲得的單細胞數(shù)據(jù)的基因組比對率只有約6.1 %，大大增加了測序成本，且通量較低。另外，單細胞CUT&Tag [9] 需要依賴Takara ICELL8這一特殊裝置。綜上，目前還缺乏一種具有普適性，易操作，高質(zhì)量的單細胞ChIP-seq技術(shù)。為此，何愛彬課題組開發(fā)出一種新型單細胞ChIP技術(shù)CoBATCH，巧妙地將染色質(zhì)片段化和PCR接頭添加融合在一步完成，顯著地提高了ChIP的效率，同時用組合標簽的方法實現(xiàn)了對單細胞進行高通量地標記，是目前世界上最先進，最高效的ChIP-seq技術(shù)，并用這項技術(shù)首次解析了多器官內(nèi)皮細胞譜系發(fā)育的表觀與功能異質(zhì)性。這項研究將單細胞表觀組學新技術(shù)的研究、普及和應用往前推進了一大步。

研究人員首先開發(fā)了一種新的適用于少量起始細胞的技術(shù)，并命名為in situ ChIP（即不需要消化分離細胞組織）。在這一技術(shù)中，作者將Protein A蛋白與轉(zhuǎn)座酶Tn5的N端進行融合得到融合蛋白Protein A-Tn5 (PAT)。將目的細胞與特定抗體孵育之后，向細胞中加入PAT融合蛋白并與特定的抗體結(jié)合。之后，激活PAT的反應活性，被抗體識別的特定基因組區(qū)域能被PAT切割，并帶上接頭序列。終止反應后，帶上接頭的目的DNA片段能直接用于PCR和建庫（圖1）。

圖1 原位細胞與組織 in situ ChIP技術(shù)原理圖

重要的是，in situ ChIP技術(shù)可直接用于不經(jīng)過消化的胚胎樣品和組織切片。研究人員對小鼠E6.5, E7.0和E7.5未經(jīng)消化的整個胚胎進行H3K27ac和H3K4me3 in situ ChIP-seq，發(fā)現(xiàn)這些組蛋白修飾在胚胎發(fā)育相關(guān)的特定基因組區(qū)域有明顯的富集，GO分析表明，這些特異富集的信號與胚層發(fā)育過程密切相關(guān)。另外，研究人員證明in situ ChIP同樣適用于捕獲少量細胞轉(zhuǎn)錄因子在基因組的結(jié)合信息。因此，in situ ChIP對樣品本身沒有限制，原管操作簡單方便，實驗能在一天內(nèi)完成，大大提高了ChIP的效率，有極強的應用價值和普適性。

進一步地，研究者對in situ ChIP進行拓展，創(chuàng)造性地將PAT處理基因組DNA與組合標簽標記單細胞兩種方法結(jié)合起來，首次開發(fā)出具有高通量特性和普適性的單細胞ChIP-seq方法，命名為CoBATCH（圖2）。其原理是將孵育完抗體的細胞分到不同的孔，用帶有不同barcode的PAT進行切割后使細胞帶上第一輪標簽，然后將所有細胞合并，重新分配到不同的孔，最后用不同的PCR引物進行擴增使細胞帶上第二輪標簽。利用這一方法，研究人員能在每一個單細胞中捕獲平均12,000個非重復DNA片段，且一次實驗通量可達10,000單細胞。與其他單細胞ChIP-seq技術(shù)相比，CoBATCH具有更高的準確性，信噪比，基因組比對率，并能捕獲更多的單細胞DNA片段。

圖2 高通量單細胞ChIP-seq CoBATCH 技術(shù)流程圖

內(nèi)皮細胞組成了哺乳動物體內(nèi)的脈管系統(tǒng)，和血液循環(huán)、造血、免疫、壓力感應以及器官形態(tài)建成等生命活動密切相關(guān)。研究者應用CoBATCH技術(shù)解析了小鼠胚胎期16.5天，來自10個器官的Cdh5+譜系的內(nèi)皮細胞的H3K27ac水平的異質(zhì)性，通過系統(tǒng)的生物信息學分析，作者精確地識別了不同的細胞亞群，它們分別與動靜脈的發(fā)育，內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT）等過程相關(guān)，并且，不同器官來源的細胞可能保留著胚層發(fā)育的表觀信息。有趣的是，作者還鑒定了一群與免疫相關(guān)的細胞，它們可能參與了免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)控。同時，心臟內(nèi)皮譜系的細胞也表現(xiàn)出很強的內(nèi)部的異質(zhì)性，作者用RNA Pol II和H3K36me3 CoBATCH單細胞數(shù)據(jù)識別出巨噬細胞樣細胞，間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等不同的細胞類型。這些研究結(jié)果證明了CoBATCH可以解析不同器官來源的內(nèi)皮細胞表觀異質(zhì)性以及順式作用元件在發(fā)育過程中的動態(tài)變化，為理解器官功能特異的內(nèi)皮細胞發(fā)育提供了重要線索。

簡而言之，CoBATCH技術(shù)是第一個具有普適性、高質(zhì)量、高通量的單細胞ChIP-seq方法，該技術(shù)將在單細胞水平上為解析細胞命運決定和功能異質(zhì)性的表觀遺傳調(diào)控機制提供強有力的支持，并對研究器官發(fā)育和疾病發(fā)生過程具有重大的意義。北京大學分子醫(yī)學研究所博士生王千昊、艾珊珊、劉雅茜和北京大學生命科學聯(lián)合中心博士生熊海清、余先紅為論文共同第一作者，何愛彬研究員為本文的通訊作者。該研究獲得了科技部干細胞專項、國家自然科學基金委的和生命科學聯(lián)合中心的支持。

參考文獻：

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[3] Buenrostro, J.D., et al., Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature, 2015. 523(7561): p. 486-90.

[4] Cao, Z., et al., A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nat Methods, 2015. 12(10): p. 959-62.

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[7] Rotem, A., et al., Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotechnol, 2015. 33(11): p. 1165-72.

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[9] Kaya-Okur, H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 1930.

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