朱志偉教授團隊在羧酸還原酶改造與設(shè)計方面取得新進展
脂肪酸是生物體內(nèi)合成的單元羧酸，其甘油三酯衍生物（俗稱油或脂肪）是重要的生產(chǎn)和生活資料，除我們熟知的食用油外，甘油三酯也是食品、飼料、生物柴油和油脂化工等行業(yè)的重要原料。其中油脂化工的主要任務(wù)是對脂肪酸進行衍生化，所生產(chǎn)的許多油脂化學(xué)品可代替石化產(chǎn)品，且品質(zhì)精良，并廣泛用于家用化學(xué)品、個人護理、藥物、橡膠、塑料，油漆和潤滑劑等。
還原脂肪酸為脂肪醇是高值化脂肪酸最重要的衍生反應(yīng)之一，但由于羧基的化學(xué)惰性，脂肪酸需預(yù)先激活形成硫脂衍生物才能進行生物還原。典型的脂肪酸硫脂衍生物包括?；o酶A（Acyl-CoA）和?；?酰基載體蛋白（Acyl-ACP），可通過還原酶催化形成脂肪醛和脂肪醇。而羧酸還原酶（Carboxylicacidreductase, CAR）是一類特殊的多功能酶，可直接利用脂肪酸為底物，其腺苷化結(jié)構(gòu)域（Adenylationdomain,Adomain）催化羧酸底物與ATP反應(yīng)生成酰基-AMP中間體，并將?；D(zhuǎn)移到肽基載體蛋白（Peptidyl carrier protein, PCP）形成共價?；?PCP硫酯中間體，該中間體再經(jīng)還原酶結(jié)構(gòu)域（Reductasedomain，Rdomain）催化還原為脂肪醛。由于羧酸還原酶獨有的特性，在脂肪酸衍生物微生物合成領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。
在前期再造酵母細胞工廠合成中鏈脂肪酸的基礎(chǔ)上（Zhu et al. Nature Chemical Biology 2017, 13:360-362;Zhu et al. Nature Catalysis 2020, 3:64-74），針對羧酸還原酶底物特異性差的缺點，為提升該酶選擇性還原中鏈脂肪酸的能力，本研究組合多種蛋白質(zhì)工程手段對羧酸還原酶進行了改造和設(shè)計。包括（1）非理性定向進化，利用羧酸還原酶有利于緩解中鏈脂肪酸細胞毒性這一特點，設(shè)計與生長偶聯(lián)的富集手段，對該酶的隨機突變文庫進行篩選，可獲得更好突變體；（2）理性定點突變，通過比較不同酶腺苷化結(jié)構(gòu)域的底物口袋，找到了控制底物鏈長的特定氨基酸殘基I303，突變該氨基酸為大側(cè)鏈色氨酸，可使酶的底物口袋變小，催化中鏈脂肪酸的活性增加；（3）半理性設(shè)計，針對還原酶結(jié)構(gòu)域中由三個氨基酸殘基（C983–M985）組成的開關(guān)序列，采用定點飽和突變加富集篩選，也可獲得活性提高的突變體；（4）結(jié)構(gòu)域替換和增添，針對羧酸還原酶只能特異性催化2e-還原，替換原有還原酶結(jié)構(gòu)域為可催化4e-還原的異源還原酶結(jié)構(gòu)域，沒有取得理想效果，然而增添一套4e-還原的異源還原酶結(jié)構(gòu)域，也可使脂肪醇合成能力提升；（5）部分突變位點的組合，顯示出協(xié)同和疊加效果。本研究設(shè)計和改造羧酸還原酶，使其催化轉(zhuǎn)化中鏈脂肪酸的能力顯著提升，為利用該酶合成中鏈脂肪醇及其衍生物提供了基礎(chǔ)。
該研究由我院朱志偉教授與瑞典查爾姆斯理工大學(xué)Jens Nielsen教授（中國工程院外籍院士）、奧地利格拉茨理工大學(xué)MargitWinkler博士等合作完成。朱志偉教授在項目提出、實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)獲取與分析、項目合作協(xié)調(diào)等方面均有重要貢獻。相關(guān)論文近日發(fā)表在權(quán)威綜合類雜志《美國國家科學(xué)院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS），瑞典查爾姆斯理工大學(xué)胡雅婷博士和朱志偉教授為論文的共同第一作者。
全文鏈接：
Hu Y, Zhu Z, Gradischnig D, Winkler M, Nielsen J, Siewers V: Engineering carboxylic acid reductase for selective synthesis of medium-chain fatty alcohols in yeast. Proc Natl AcadSci USA 2020:202010521.
https://www.pnas.org/content/117/37/22974.short
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