Cell | 白凡課題組與合作團隊揭示兒童結腸炎及炎癥性腸病的致病機制及治療方法
2019年11月14日，北京大學白凡研究員團隊與廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所張玉霞研究員，國家臨床重點?？苾嚎葡瘓F隊（楊敏、耿嵐嵐及龔四堂主任醫(yī)師）合作在《Cell》以長文形式發(fā)表了題為“Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways”的研究論文，報道了這一兒童疾病研究領域的重大進展。
1. 隊列特征與單細胞轉錄組圖譜
研究團隊回顧了2016 ~ 2019年廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心消化內科招募的306名患兒，并根據臨床、生化檢驗、內鏡和組織病理學等評分將患兒分為對照、結腸炎（colitis），潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩?。–D）組。結腸炎又分為輕（分級1）、中（分級2）、重度（分級3）三個等級。腸鏡時，中-重度結腸炎及UC和CD患者的血紅蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)顯著降低，而超敏C反應蛋白（hsCRP）和血小板計數則升高（圖1A-C）。為了闡述致病機制及研究藥物靶點，研究團隊對17名患兒（包括對照組及PIBD各亞型）的結腸黏膜進行了單細胞轉錄組及TCR+BCR分析，并將中國兒童的風險基因與各細胞亞型的轉錄特征進行了關聯（圖1D-E）。
圖1 隊列特征與結腸黏膜單細胞圖譜
2. 腸上皮細胞富集風險基因
單細胞測序將腸上皮細胞分為了10個亞群，風險基因富集在不同的細胞亞群上，發(fā)揮的功能不盡相同（圖2）。比如CASP7可能引起腸上皮（coloncytes）凋亡； DVL1可能通過catenin/WNT通路影響上皮細胞的再生；表達在Goblet細胞上的離子通道PIEZO1可能對周圍的力學環(huán)境比較敏感（圖2D-F）。這些蛋白的失調最終可能促進兒童結腸炎及炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展。
圖2 PIBD與對照組結腸上皮細胞的組成與功能差異
3. 兒童結腸炎及炎癥性腸病結腸黏膜富集炎性成纖維細胞且血管生成增加
結腸黏膜成纖維細胞和血管內皮細胞共有8個亞群（圖3A）。PIBD的腸黏膜含有大量WNT2B高表達和炎性成纖維細胞，這些細胞富集TNFα, NF-κB和壓力應答等通路，其中炎性成纖維細胞只在UC中富集（圖3B-D）。PIBD中的成纖維細胞分泌更多的能招募并活化髓系細胞的CCL和CXCL家族趨化因子（圖3B）。研究團隊還發(fā)現疾病組的血管生成以及免疫細胞跨內皮遷移增加（圖3E-F）。
圖3 PIBD與對照組的成纖維與內皮細胞組成與功能差異
4. 兒童結腸炎及炎癥性腸病結腸黏膜富集高炎性髓系細胞
CD68+的髓系細胞在PIBD中，尤其是UC和CD患者中的浸潤顯著增加（圖4A），且高表達IL1β和TNFα的巨噬細胞幾乎只存在PIBD中，這類細胞中行使降解胞內cAMP功能的磷酸二酯酶4B（PDE4B）表達升高（圖4B-F）。抑制PDE4B可以降低炎癥因子的釋放，研究團隊通過體外細胞實驗證實靶向PDE4B的臨床藥物雙嘧達莫可以顯著抑制TNFα，IL1β和IL6的釋放（圖4G-I）。
圖4 PIBD結腸黏膜富集炎性髓系細胞
5. 結腸黏膜CD39缺乏誘導血小板活化和5-羥色胺累積
結合單細胞測序和免疫細胞表型分析，研究團隊描述了不同T亞群的克隆擴增及轉化情況（圖5A-F）。值得關注的是，細胞表面表達的核酸外切酶CD39在CD8+和Vδ1+T細胞的表達在PIBD各亞型中顯著降低（圖5G）。CD39受cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB調控，可以降解胞外的ATP和ADP，研究團隊證實CD39表達缺失確實會導致腸黏膜ADP濃度增加，從而激活血小板促進5-羥色胺的釋放，最終誘導黏膜損傷；也通過體外細胞實驗證實了靶向PDE4B的臨床藥物雙嘧達莫可以提高Navie CD8+T細胞的CD39表達（圖5H-I），這與單細胞轉錄組分析及過往報道提示提高cAMP可能促進CD39的表達相符。
圖5 PIBD結腸黏膜缺乏CD39+的上皮T淋巴細胞
6. 雙嘧達莫在防治兒童結腸炎及炎癥性腸病方面的應用前景
為了證實第二信使激動劑在治療PIBD的應用潛力，研究團隊利用腹腔注射雙嘧達莫的方式對硫酸葡聚糖（DSS）誘導的急性腸炎小鼠進行了治療，發(fā)現雙嘧達莫可以顯著改善小鼠的體重、結腸長度和結腸的組織病理結構，抑制小鼠結腸黏膜的血小板聚集和TNFα的釋放（圖6A-D）。對9例患兒（8例結腸炎和1例未定型IBD）開展了雙嘧達莫的小隊列臨床試驗，發(fā)現患者的血小板計數，結腸鏡評分和臨床綜合評分均有明顯改善（圖6E）。其可能的機制是雙嘧達莫通過cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途徑提高CD39的表達，從而抑制血小板的聚集和活化（圖6F-G）；同時，該藥可以抑制CD68+髓系細胞及TNFα的釋放（圖6H），最終緩解臨床癥狀。
圖6 雙嘧達莫在臨床上可以緩解結腸炎
總結：
研究團隊利用深度免疫分型并結合單細胞轉錄組測序技術、全基因組關聯分析（GWAS）、體外、動物實驗和臨床測試，揭示了結腸炎和炎癥性腸病患兒腸黏膜多個細胞亞型中的cAMP通路被抑制，從而導致級聯免疫紊亂并最終促進了PIBD的發(fā)生發(fā)展（圖7）。本文還發(fā)現了胞內第二信使激動劑雙嘧達莫可以提高cAMP，增加CD39的表達，抑制炎性因子分泌和血小板活化，從而為兒童結腸炎及炎癥性腸病的防治開拓了新的領域（圖7）。未來，此類藥物可能會成為兒童和/或成人胃腸炎癥疾病的另一種臨床防治選擇，有助于降低醫(yī)療成本，促進社會和諧。但是因臨床環(huán)境較為復雜，潘生丁的使用需要繼續(xù)進行臨床實驗。具體用藥請咨詢臨床醫(yī)生。
圖7 本課題的技術路線與致病機制
廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所黃冰博士，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心的陳章華博士研究生，以及廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所的王俊副研究員，消化科耿嵐嵐主任醫(yī)師和數據中心梁會營主任為本文的并列第一作者，張玉霞、楊敏、白凡和龔四堂為本文的共同通訊作者。
合作團隊聲明本文所述實驗，均經過廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會，中國臨床試驗注冊中心，以及廣州醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會的批準和通過，并嚴格按照批件所述的要求和流程實施。實驗所涉及的遺傳數據遵循國家管理辦法進行儲存和備案。
原文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31177-8
白凡 簡介：北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心、生命科學學院研究員，博士生導師，國家自然科學基金委優(yōu)秀青年基金獲得者。2003年本科畢業(yè)于北京大學物理系，2008年獲英國牛津大學生物物理博士學位。全職回國之后，白凡實驗室致力于將先進的單細胞技術應用于重大醫(yī)學疾病問題的研究，在癌癥轉移和異質性研究領域和細菌抗生素耐藥研究領域取得多項重大研究成果，已在Science, Nature, Cell, Cancer Cell, Molecular Cell, PNAS等著名學術期刊發(fā)表論文60余篇。
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