任國棟團隊揭示HYL1拮抗外切體調(diào)控miRNA加工生成新機制
7月7日，我院遺傳工程國家重點實驗室任國棟研究員課題組在《美國科學院院刊》（PNAS）上發(fā)表了題為《雙鏈RNA結合蛋白HYL1保護miRNA前體分子免受核內(nèi)外切體攻擊》“Hyponastic Leaves 1 protects pri-miRNAs from nuclear exosome attack”的研究論文。該研究揭示了擬南芥雙鏈RNA結合蛋白 HYL1在 miRNA加工成熟過程中保護底物分子（pri-miRNA及其加工過程中間產(chǎn)物）免受核酸外切體（exosome）攻擊的新機制，并發(fā)現(xiàn)HYL1可能在DCL1介導的由環(huán)到基部（Loop-to-base）和基部到環(huán)（Base-to-loop）成熟的pri-miRNAs 加工過程中發(fā)揮不同作用。
miRNA是一類長度在20-24堿基的內(nèi)源小分子RNA，在動植物生長發(fā)育、細胞命運決定和轉(zhuǎn)換、以及環(huán)境應答等幾乎所有生物學過程中發(fā)揮重要作用。miRNA初級轉(zhuǎn)錄本（稱為pri-miRNA）可以折疊成莖區(qū)不完全配對的發(fā)夾結構，該結構可被RNase III家族核酸內(nèi)切酶識別并切割后釋放出成熟的雙鏈miRNA/miRNA*。和動物相比，植物 pri-miRNA的莖環(huán)區(qū)長度變異更大（從60 nt到超過500 nt，動物中一般為~70 nt），從而增加了莖環(huán)結構的復雜性。因此植物除了經(jīng)典的基部到環(huán)的加工方式，不少miRNA以環(huán)到基部的切割方式成熟，有些長的pri-miRNA還存在兩次以上的連續(xù)切割 (圖1)。
圖1、植物miRNA的兩種加工機制（Bologna and Voinnet, 2014 ）
在植物中，DCL1在HYL1和鋅指蛋白SE等的幫助下負責絕大多數(shù)miRNA的加工成熟。HYL1被認為是DCL1最重要的伴侶分子，推測其在miRNA加工過程中的功能類似于動物miRNA生成中Drosha的伴侶蛋白DGCR8和Dicer的伴侶蛋白TRBP。已有的研究表明HYL1有助于提高DCL1加工的效率和準確性，但其具體的作用機制以及HYL1是否還有其他生物學功能仍不清楚。
外切體是生物體最主要的負責各類RNA降解的蛋白質(zhì)機器，在rRNA加工成熟、正常RNA周轉(zhuǎn)降解以及非正常RNA（如錯誤轉(zhuǎn)錄本、RNA加工副產(chǎn)物、靶基因切割產(chǎn)物等）的及時清除等細胞基本生命活動過程中發(fā)揮關鍵作用。外切體核心復合物共含9個蛋白（Exosome 9，exo9），在古菌和真核生物中高度保守。核心復合物通過與不同輔助因子互作參與不同RNA底物的識別和降解。根據(jù)亞細胞定位的不同，外切體可分為胞質(zhì)外切體與核內(nèi)外切體，核內(nèi)外切體又分為核仁外切體與核質(zhì)外切體。RNA解旋酶SKI2、MTR4以及HEN2分別是胞質(zhì)外切體、核仁外切體與核質(zhì)外切體的重要輔助成員。
該研究通過正向遺傳學篩選hyl1-2的表型抑制子，結合圖位克隆分離鑒定到核質(zhì)外切體的另一輔助因子SOP1。SOP1蛋白C端含有5個串聯(lián)的CCCH型鋅指結構，可能與RNA結合有關。SOP1與HEN2共定位，參與部分核質(zhì)外切體靶標RNA的降解。在hyl1-2中引入HEN2的突變同樣可以顯著抑制hyl1-2的發(fā)育缺陷，表明SOP1和HEN2很可能是通過外切體途徑參與miRNA調(diào)控的 (圖2A)。通過對miRNA以及pri-miRNA的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，hyl1 sop1 雙突變體中加工方向為環(huán)到基部的pri-miRNA較hyl1有更高的積累，對應成熟miRNA表達水平得到了顯著回復，表明SOP1選擇性參與hyl1突變體中加工方向為環(huán)到基部的pri-miRNA降解（圖2B&C）。令人驚訝的是，hyl1 hen2雙突變體中幾乎所有的pri-miRNA均顯著累積，但是只有環(huán)到基部成熟的miRNA得到了回復（圖2B&C）。該研究結果表明當HYL1缺失時，環(huán)到基部加工的pri-miRNA的更多累積可以促進miRNA的生成，而基部到環(huán)加工的pri-miRNA則不能。加工復合體成員SE能夠與HEN2相互作用，猜測可能在招募外切體中發(fā)揮功能。
圖2、HYL1拮抗核內(nèi)外切體，確保pri-miRNA加工順利進行。
綜上，該研究揭示了外切體在pri-miRNA生物發(fā)生中的監(jiān)控作用以及加工復合體核心成員HYL1的保護功能，拓展了我們對于加工過程中pri-miRNA質(zhì)量控制機制的認識。此外，該研究還系統(tǒng)鑒定了受HEN2、SOP1影響的差異表達基因，這些基因可作為核質(zhì)外切體功能的標志基因。
任國棟課題組博士后高帥（現(xiàn)工作于廣東省生物工程研究所）、博士研究生王鏡諭以及生命學院姜寧青年副研究員為本文的共同第一作者，任國棟研究員為通訊作者，復旦大學為第一單位。遺傳工程國家重點實驗室常芳教授、王應祥教授以及蒯本科教授團隊參與了本項目的研究；晶能生物技術(上海)有限公司提供了測序方面的技術支持。該研究受國家自然科學基金和國家重點研發(fā)計劃項目資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2007203117
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