趙冰、林鑫華教授團(tuán)隊(duì)合作用人源類器官模型證實(shí)SARS-CoV-2感染和損傷膽管組織
新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的疾?。–OVID-19）已對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅。值得注意的是，COVID-19患者常見(jiàn)肝功能異常，一項(xiàng)對(duì)我國(guó)1099例COVID-19患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)約20%的患者ALT（ alanine aminotransferase，谷丙轉(zhuǎn)氨酶）和AST（aspartate aminotransferase，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）升高，約10%的患者TBIL（total bilirubin，總膽紅素）升高，特別是重度患者肝損傷的發(fā)生率明顯高于非重度患者，提示患者發(fā)生了不同程度的肝損傷【1】。然而，關(guān)于COVID-19患者肝損傷是由肝內(nèi)病毒感染直接引起還是由細(xì)胞因子風(fēng)暴等系統(tǒng)原因間接引起尚不清楚。且目前對(duì)SARS-CoV-2致病機(jī)制的研究主要依賴于生物信息學(xué)分析、臨床特征分析、動(dòng)物模型以及珍貴的遺體解剖報(bào)告，尚缺乏人體組織感染模型。
2020年4月17日，復(fù)旦大學(xué)趙冰、張榮、林鑫華，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院梁俊波，合作在Protein & Cell上發(fā)表了題為Recapitulation of SARS-CoV-2 infection and cholangiocyte damage with human liver ductal organoids的研究論文【2】。該研究建立了人源類器官的SARS-CoV-2感染模型，并研究其組織損傷機(jī)制。證明SARS-CoV-2可以感染膽管上皮細(xì)胞，并下調(diào)膽管組織中細(xì)胞緊密連接及膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，為新冠病毒細(xì)胞嗜性、致病機(jī)制研究和后續(xù)藥物研發(fā)提供重要工具，并提示膽管功能紊亂可能是部分新型冠狀病毒感染者肝臟損傷的直接誘因。
研究者通過(guò)單細(xì)胞表達(dá)譜測(cè)序發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)的肝臟（膽管）類器官保存了新冠病毒受體ACE2和感染輔助蛋白TMPRSS2雙陽(yáng)性的膽管上皮細(xì)胞類群（下圖），提示人肝臟膽管類器官可以模擬ACE2及TMPRSS2（2020年2月28日，德國(guó)萊布尼茨靈長(zhǎng)類研究所團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表論文，在細(xì)胞水平上確認(rèn)了SARS-CoV-2感染細(xì)胞的受體是ACE2，且感染過(guò)程和SARS-CoV相似，并依賴于絲氨酸蛋白酶TMPRSS2）共同介導(dǎo)的SARS-CoV-2感染。
對(duì)類器官的SARS-CoV-2感染實(shí)驗(yàn)顯示，感染24小時(shí)后SARS-CoV-2核衣殼蛋白（N protein）在類器官部分膽管細(xì)胞中呈陽(yáng)性，顯示病毒已經(jīng)成功侵染并復(fù)制，受感染的膽管細(xì)胞還會(huì)經(jīng)膜融合形成合胞體（下圖）。qRT-PCR分析顯示感染后24小時(shí)類器官內(nèi)的病毒載量顯著增加，表明人膽管上皮細(xì)胞是SARS-CoV-2的易感宿主，并可支持病毒的活躍復(fù)制。雖然病毒可感染的細(xì)胞比例較低，但通過(guò)對(duì)感染前后膽管類器官的轉(zhuǎn)錄組分析后發(fā)現(xiàn)病毒感染導(dǎo)致三百多個(gè)基因表達(dá)水平的顯著改變。GO富集分析顯示感染后參與調(diào)控細(xì)胞死亡的相關(guān)基因變化明顯，其中幾個(gè)重要的凋亡相關(guān)基因CARD8、STK4等表達(dá)顯著上調(diào)，提示感染可誘發(fā)膽管細(xì)胞凋亡。
在體內(nèi)膽管的主要功能是將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到膽管腔內(nèi)排出，膽管細(xì)胞之間的緊密連接維持了膽管上皮的屏障功能，對(duì)膽汁酸的收集和排泄至關(guān)重要。研究者發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染降低了類器官中Claudin1等緊密連接相關(guān)基因的表達(dá)，提示膽管細(xì)胞的屏障功能可能被破壞。更重要的是，兩個(gè)主要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，頂端鈉離子/膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)和囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)的基因表達(dá)在SARS-CoV-2感染后顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)支持SARS-CoV-2感染可以通過(guò)下調(diào)膽管細(xì)胞中緊密連接形成和膽汁酸運(yùn)輸關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，損傷膽管組織屏障和膽汁酸運(yùn)輸功能。提出COVID-19患者肝內(nèi)病毒感染誘發(fā)膽管功能紊亂和膽汁積淤，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷的可能性。
該研究于2020年3月17日在預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv上發(fā)布，是COVID-19疫情爆發(fā)之后利用人源類器官研究SARS-CoV-2感染和致病機(jī)制的首次報(bào)道。除了肝臟之外，其他重要臟器(肺、腸和腎等)的類器官培養(yǎng)技術(shù)也日漸成熟，廣泛利用人源類器官研究SARS-CoV-2在多臟器中的病毒嗜性、復(fù)制動(dòng)態(tài)以及先天免疫應(yīng)答值得期待。相比于復(fù)雜動(dòng)物模型，類器官病毒感染模型進(jìn)行的新型抗病毒藥物藥效和毒性評(píng)價(jià)將更加直接和便捷。
據(jù)悉，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員趙冰、博士后倪超和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所博士研究生高然為共同第一作者，趙冰、梁俊波、張榮、林鑫華為共同通訊作者，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王曉月研究員和復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院袁正宏教授為高級(jí)作者。本項(xiàng)工作依托復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室類器官研究中心開(kāi)展，該中心現(xiàn)擁有GMP屏障400平方米，配備高通量類器官培養(yǎng)及表型分析設(shè)備，并積累了國(guó)際領(lǐng)先的技術(shù)實(shí)力。通過(guò)與復(fù)旦大學(xué)附屬醫(yī)院合作，已建立腸、肝、肺、子宮內(nèi)膜等正常組織類器官和腫瘤類器官種質(zhì)資源庫(kù)。復(fù)旦大學(xué)新冠科研攻關(guān)團(tuán)隊(duì)和生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室為本項(xiàng)工作提供重要技術(shù)指導(dǎo)與支持。
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http://doi.org/10.1007/s13238-020-00718-6
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