核酸快速檢測對于臨床診斷和生物技術應用不可或缺。最近,基于CRISPR系統(tǒng)的基因編輯技術也被應用于基因檢測。借助于Cas13a和Cas12a的附帶切割活性開發(fā)的SHERLOCK系統(tǒng),DETECTR系統(tǒng)和HOLMES系統(tǒng)實現(xiàn)了針對病原體和腫瘤基因的精準檢測。但是,在這些檢測系統(tǒng)中通常將核酸擴增和檢測步驟分開,開蓋操作極易造成擴增子氣溶膠污染,產(chǎn)生 “假陽性”結(jié)果。此外,目前的CRISPR檢測技術需要借助熒光設備,并且至少需要一個小時才能完成,不適用于低成本的核酸現(xiàn)場快速檢測。
針對這一問題,王永明團隊探索了重組聚合酶擴增和Cas12a切割兼容的體系,并且開發(fā)了Cas12aVDet (Cas12a-based Visual Detection)可視化檢測方法,首次將核酸擴增和檢測體系置于同一反應管中,反應完成后在藍光激發(fā)下直接通過肉眼觀察結(jié)果,整個過程可在30 min內(nèi)完成。該方法操作簡便,檢測快速,檢測結(jié)果肉眼可見,檢測靈敏度達到單分子水平。相關成果于2019年8月28日以“Cas12aVDet: a CRISPR/Cas12a-based platform forrapid and visual nucleic acid detection”為題在線發(fā)表在美國化學會《American Chemical Society》旗下主要期刊《分析化學》(Analytical Chemistry)上。
圖1 Cas12aVDet可視化核酸快速檢測方法原理圖
如上圖所示,該方法首先將RPA擴增試劑和除Cas12a酶外的Cas12a切割體系試劑混勻后置于管內(nèi),Cas12a酶置于管壁。然后,在37℃條件下反應15min進行RPA擴增。隨后,將Cas12a酶離心到反應液中在37℃條件下繼續(xù)反應15min進行Cas12a切割。最后,在藍光燈激發(fā)下通過肉眼觀察檢測結(jié)果,陽性樣本將呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光,陰性樣本無熒光產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn),Cas12aVDet方法可實現(xiàn)對核酸的快速檢測,檢測靈敏度可達到單分子水平。該方法成本低廉,操作簡便,在疾病診斷、致病菌檢測以及便攜式檢測設備開發(fā)中具有極大的應用潛力。
圖2針對靶位點設計的特異性識別序列及其核酸熒光檢測結(jié)果圖
通過檢測質(zhì)粒上的靶位點對Cas12aVDet可視化檢測體系進行評估。首先,針對靶位點分別設計crRNA1和crRNA2特異性識別序列(如圖a所示)。接著,采用Cas12aVDet可視化檢測體系進行檢測,檢測熒光值和可視化檢測結(jié)果的對比數(shù)據(jù)如圖b所示。結(jié)果顯示陽性樣本呈現(xiàn)出強烈的綠色熒光,可與陰性樣本進行明顯區(qū)分,檢測結(jié)果可采用肉眼觀察或手機拍照。
王永明課題組的碩士生王貝和浙江大學博士生王瑞為該論文的共同第一作者,王永明教授為該論文的通訊作者。
全文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b01526
版權與免責聲明:本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享,并不意味著贊同其觀點或證實其真實性,也不構成其他建議。僅提供交流平臺,不為其版權負責。如涉及侵權,請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱:sales@allpeptide.com