《自然》刊登南京大學戈惠明、譚仁祥和梁勇團隊研究成果：自然界中首例催化[6+4]環(huán)加成反應的酶
周環(huán)反應是一類在反應過程中形成環(huán)狀過渡態(tài)的協(xié)同反應，比如著名的[4+2]環(huán)加成反應（Diels-Alder反應）、Cope-重排反應、Claisen-重排反應等，這些反應在有機合成中有著廣泛的應用。有意思的是，在自然界中也觀察到了可催化這些著名周環(huán)反應的酶。早在1965年，Woodward和Hoffmann兩位諾貝爾化學獎獲得者就預測了[6+4]或其它高階環(huán)加成反應可以發(fā)生，隨后在有機合成中確實觀察到了[6+4]反應，但自然界中是否存在著可催化[6+4]反應的酶仍然是個謎。???
南京大學戈惠明、譚仁祥和梁勇研究團隊首次鑒定出能夠催化[6+4]環(huán)加成反應的一類酶家族，相關成果“Enzyme-catalysed [6+4] cycloadditions in the biosynthesis of natural products”2019年3月13日在線發(fā)表在英國《自然》雜志上。南京大學助理研究員張博博士、以及博士研究生王凱標、王文和汪欣為該論文共同第一作者。戈惠明、譚仁祥、梁勇以及加州大學洛杉磯分校的Kendall N. Houk教授為共同通訊作者。
該團隊在前期工作中，從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了一個具有抗幽門螺旋桿菌活性的新穎大環(huán)內酯化合物命名為streptoseomycin，根據(jù)其結構推斷，它在微生物體內的合成過程中可能涉及[4+2]環(huán)加成反應。為鑒定此過程，他們比較分析了streptoseomycin以及其結構類似物nargenicin的生物合成基因簇，推測一個未知功能的同源蛋白StmD、NgnD很有可能分別負責streptoseomycin和nargenicin中的環(huán)化反應。然而，敲除stmD?基因并未得到預料中的環(huán)化產(chǎn)物前體3?，而得到了線性化合物4?和5?，這很可能是化合物3?環(huán)內雙鍵較多，張力較大，自發(fā)水解開環(huán)所致。研究人員設計了一個在微生物體內驗證StmD功能的實驗，首先敲除了基因簇上大部分基因，僅留下聚酮合成酶基因，此突變株只產(chǎn)生化合物4?；當將stmD?基因回補回去時，得到了化合物6??8?，其中化合物7?不穩(wěn)定，可經(jīng)Cope重排轉化成6?。該結果表明，聚酮合成酶的直接產(chǎn)物是3?，若無下游其它酶存在時，3?將發(fā)生水解開環(huán)而生成4?；若再引入StmD，則催化發(fā)生周環(huán)反應，奇怪的是，該酶不僅催化了[4+2]反應，也催化了[6+4]反應。???
隨后，研究人員設計了兩步串聯(lián)的酶反應在體外來驗證周環(huán)酶的催化功能。首先，通過聚酮合成酶上的硫酯酶結構域催化鏈狀化合物4?-SNAC環(huán)化形成3?，當同時加入StmD或NgnD時，反應體系中觀察到了化合物6??8?的生成，確證StmD或NgnD可同時催化[4+2]和[6+4]反應。此外研究人員以StmD為探針從公共基因組數(shù)據(jù)庫中，挖掘鑒定出了另外三個可催化此反應的酶。???
為了更好地理解[6+4]、[4+2]環(huán)加成反應和[3,3]-Cope重排反應之間的相互關系，研究人員通過密度泛函理論計算了反應的熱力學和動力學。有趣的是，底物3?越過單一過渡態(tài)后可歧化成兩個方向，分別生成[6+4]、[4+2]反應產(chǎn)物，由于[6+4]化合物在熱力學上更穩(wěn)定，[4+2]產(chǎn)物可再經(jīng)Cope重排自發(fā)轉化成[6+4]產(chǎn)物。此理論計算結果與實驗觀察結果相吻合，進一步證明了之前的推斷。???
最后，研究者獲得了StmD、NgnD和101015D三個蛋白的晶體來進一步研究該反應的催化機理。通過分子對接、計算機模擬和點突變實驗，闡明了此類新型環(huán)加成酶的反應機制。M69中富含電子的硫原子會特定的指向過渡態(tài)中部分帶正電的雙烯部分，從而產(chǎn)生有利的靜電作用；同時反應物中部分帶負電的三烯酯會與W67上的芳香環(huán)產(chǎn)生π–π堆疊相互作用，來穩(wěn)定過渡態(tài)并加速整個反應的進行。此外，Y55和Y13也會通過分子間氫鍵和CH–π相互作用來催化反應。???
綜上所述，研究人員巧妙設計實驗，通過體內敲除基因、體外酶催化反應、量子化學計算、分子動力學模擬以及蛋白晶體的研究等，表征了首例可催化[6+4]/[4+2]環(huán)加成反應的酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)將進一步拓展人們對周環(huán)反應酶的認識，啟發(fā)科學家們將來利用和改造周環(huán)反應酶來實現(xiàn)有價值的分子轉化。???
該研究得到了國家重點研發(fā)計劃，國家自然科學基金委優(yōu)青項目、重點項目，中組部青年海外高層次人才計劃，江蘇省特聘教授計劃等的資助，特別感謝南京大學配位化學國家重點實驗室以及醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室，以及人工微結構科學與技術協(xié)同創(chuàng)新中心高性能計算中心和南京大學高性能計算中心提供的服務。???
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