顧宏周團(tuán)隊(duì)與合作者在《Nature Communications》發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)可通過同時(shí)感應(yīng)SAM和tRNA配體精確調(diào)控基因表達(dá)
核糖開關(guān)（Riboswitches）是一類非編碼RNA元件，主要存在于細(xì)菌mRNA的5′非編碼區(qū)（5′UTR），通常由適配體（aptamer）和表達(dá)平臺(tái)（expression platform）兩個(gè)功能域組成。當(dāng)特定分子（ligand，配體）結(jié)合適配體域時(shí)，會(huì)引起表達(dá)平臺(tái)域的局部構(gòu)象發(fā)生變化，從而打開或關(guān)閉下游基因的表達(dá)。核糖開關(guān)廣泛存在于細(xì)菌中，它們在細(xì)菌的硫代謝、輔酶合成、氨基酸合成等基礎(chǔ)代謝中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，迄今為止，已有20余類感應(yīng)不同分子的核糖開關(guān)在細(xì)菌中被確認(rèn)。
十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）屬于黃單胞桿菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌，是引起十字花科植物（包括重要的蔬菜如白菜、蘿卜、甘藍(lán)，重要的油料作物油菜，以及模式植物擬南芥等）黑腐病的病原菌，也是研究微生物與寄主相互作用分子機(jī)理的主要模式菌之一。此前的研究發(fā)現(xiàn)，在Xcc的合成甲硫氨酸必須的操縱子（met操縱子）mRNA的5′UTR區(qū)，存在一段與SAM-I型核糖開關(guān)適配體區(qū)相似的序列（注：核糖開關(guān)多以其識(shí)別的配體分子命名，按照RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特征又可分為多個(gè)亞型），預(yù)示在Xcc中Met的合成可能由SAM-I核糖開關(guān)控制。但是該潛在的SAM-IXcc核糖開關(guān)缺乏已知的核糖開關(guān)表達(dá)平臺(tái)的明顯特征，其可能的調(diào)控功能及機(jī)制均不清楚。
近日，我院顧宏周研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院唐紀(jì)良教授團(tuán)隊(duì)，研究發(fā)現(xiàn)SAM-IXcc RNA在黃單胞菌屬中是高度保守的，并且是一類獨(dú)特的具有雙重識(shí)別功能的核糖開關(guān)：既可以通過適配體區(qū)域結(jié)合SAM后關(guān)閉Met的合成，也可以通過表達(dá)平臺(tái)區(qū)域與空載的Met-tRNA互作從而打開Met的合成，且雙重感應(yīng)可以同時(shí)發(fā)生。換言之，SAM和空載的Met-tRNA同時(shí)作用于SAM-IXcc 協(xié)調(diào)著Met的合成。小分子（SAM）和tRNA同時(shí)作用于一個(gè)核糖開關(guān)協(xié)同控制著基因表達(dá)是一個(gè)全新的發(fā)現(xiàn)。6月3日，相關(guān)成果以《SAM-I型核糖開關(guān)雙重感應(yīng)非荷載的起始tRNA》（SAM-I riboswitch with the ability to sense and respond to uncharged initiator tRNA）為題，在線發(fā)表于Nature Communications雜志上。
研究者首先通過融合了SAM-IXcc RNA的reporter體系證實(shí)該核糖開關(guān)能特異地感應(yīng)SAM并在翻譯水平上起調(diào)控作用；進(jìn)一步的，利用具有單堿基分辨率的in-line probing探測手段，重構(gòu)了SAM-IXcc RNA的二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與已知的SAM-I核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)具有高度相似性；同時(shí)，in-line probing實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次確認(rèn)SAM-IXcc RNA可以很好的結(jié)合SAM并區(qū)分其類似物SAH或Met（圖1）。
圖1. 確認(rèn)Xcc中的I型SAM核糖開關(guān)
研究者很快發(fā)現(xiàn)SAM-IXcc 核糖開關(guān)結(jié)合SAM后可以很好的關(guān)閉下游基因表達(dá)，反映在核糖體結(jié)合位點(diǎn)Shine-Dalgarno（SD）序列以及翻譯起始密碼子AUG均被屏蔽在穩(wěn)定的RNA Stem里；然而，在不結(jié)合SAM時(shí)，整個(gè)開關(guān)處于“半打開”狀態(tài)：起始密碼子AUG暴露了出來，但是SD序列依然被屏蔽（圖2）。這種不徹底的打開較為異常，有別于已知的核糖開關(guān)工作原理。這促使研究者思考是否有其它因素共同參與SAM-IXcc 核糖開關(guān)的調(diào)控？
圖2. SAM-IXcc 感應(yīng)SAM并在翻譯水平上的調(diào)控
在細(xì)菌中，已知有兩類核糖開關(guān)分別調(diào)控著Met的合成，SAM核糖開關(guān)是其中一類（又稱為S Box），另一類為T Box。通常S Box感應(yīng)到高濃度的SAM后會(huì)關(guān)閉Met的合成，而T Box感應(yīng)到積聚的空載Met-tRNA后會(huì)打開Met的合成。在Xcc中，SAM-IXcc下游的第一個(gè)基因Homoserine O-acetyltransferase（encoded by XC1251，圖1a）緊密參與著Met的合成代謝并延伸至負(fù)載Met-tRNA的合成（圖3），因此研究者猜測空載的Met-tRNA可能就是參與SAM-IXcc 核糖開關(guān)SD區(qū)打開或屏蔽的其它因素，盡管SAM-IXcc不具備已知T Box的特征序列。
圖3. Xcc中Met和SAM的合成及代謝途徑
凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）很快證明了該猜測：SAM-IXcc的表達(dá)平臺(tái)能夠與空載的起始Met-tRNA（tRNAfMet）結(jié)合，并且這種結(jié)合非常特異，Xcc中的其它所有tRNA以及負(fù)載了Met的tRNAfMet都不具備這種結(jié)合能力；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在SAM-IXcc核糖開關(guān)上的結(jié)合位點(diǎn)就是屏蔽SD的抗SD序列（anti-SD），當(dāng)空載的tRNAfMet 結(jié)合了SAM-IXcc后，SD序列才得到徹底的釋放。但是空載的tRNAfMet通過哪些堿基如何與SAM-IXcc形成特異互作的，目前尚不清晰，有待進(jìn)一步的研究。
最后，研究者提出了SAM-IXcc的調(diào)控模型（圖4）：當(dāng)Xcc中的空載tRNAfMet濃度低時(shí)，意味著Met濃度高（tRNA都處于裝載狀態(tài)），若此時(shí)SAM濃度也高，則SAM結(jié)合到SAM-IXcc上完全關(guān)閉Met/SAM的合成（OFF），節(jié)約原料并合理控制SAM和Met水平；但如果此時(shí)SAM濃度低，那么SAM-IXcc則不結(jié)合SAM從而半打開Met的合成通路（Partial ON 1），因?yàn)镸et的濃度已經(jīng)是足夠高的，無須迫切提升Met，當(dāng)一部分Met被合成轉(zhuǎn)化為SAM后，SAM的濃度自然得到補(bǔ)足而Met的濃度也可以維持在一個(gè)合理的水平。類似的，當(dāng)Xcc中的空載tRNAfMet濃度高時(shí)，意味著Met濃度低，若此時(shí)SAM濃度也低，則空載的tRNAfMet結(jié)合到未結(jié)合SAM的SAM-IXcc上，完全釋放出SD和AUG序列，核糖開關(guān)完全打開Met/SAM的合成（Full On），從而可盡快恢復(fù)SAM和Met的水平；但如果此時(shí)SAM濃度高，那么SAM-IXcc則同時(shí)結(jié)合SAM以及空載的tRNAfMet，釋放出SD序列但仍屏蔽AUG，從而半打開Met的合成通路（Partial ON 2），一定程度上補(bǔ)足Met的水平即可。
圖4. SAM-IXcc的假想工作模型
綜上所述，該研究在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型的SAM-I型核糖開關(guān)，它的表達(dá)平臺(tái)區(qū)又隱藏著一個(gè)感應(yīng)tRNA的開關(guān)。這樣的雙重開關(guān)被認(rèn)為可以更和諧更合理地調(diào)控Met的合成代謝通路，使得相應(yīng)的細(xì)菌在進(jìn)化的過程中更具備生存優(yōu)勢。這項(xiàng)研究豐富了我們對(duì)核糖開關(guān)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為更好地干預(yù)細(xì)菌的代謝提供了新的思路。
據(jù)悉，我院顧宏周研究員和廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院唐紀(jì)良教授為本文的共同通訊作者。唐東階（廣西大學(xué)）、杜鑫雨（復(fù)旦大學(xué)/附屬浦東醫(yī)院）、時(shí)強(qiáng)（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院）、張建玲（廣西大學(xué)/遵義醫(yī)科大學(xué)）為本文共同第一作者。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-16417-z
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