Nature Biotechnology | 魏文勝課題組報(bào)道新型基因編輯技術(shù)
2019年7月15日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏文勝課題組以長文形式在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為 “Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs” 的研究論文，首次報(bào)道了名為LEAPER的新型RNA 單堿基編輯技術(shù)。與傳統(tǒng)的核酸編輯技術(shù)需要向細(xì)胞同時(shí)遞送編輯酶(如Cas蛋白)及向?qū)NA不同，LEAPER系統(tǒng)僅需要在細(xì)胞中表達(dá)向?qū)NA即可招募細(xì)胞內(nèi)源脫氨酶實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA的編輯。利用該技術(shù)，研究人員在一系列疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本中實(shí)現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)的編輯，并成功修復(fù)了來源于Hurler綜合征病人的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷細(xì)胞。該技術(shù)的建立為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病治療提供了一種全新的工具。
近年來，以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，但該技術(shù)目前存在的一系列問題使其在臨床治療應(yīng)用中遭遇瓶頸。問題的根源之一在于當(dāng)前的基因編輯體系依賴于外源編輯酶或效應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而造成 (1) 蛋白分子量過大使得通過病毒載體進(jìn)行裝載及人體內(nèi)遞送十分困難；(2) 由蛋白過表達(dá)引起的DNA/RNA水平的脫靶效應(yīng)；(3) 由外源蛋白表達(dá)引起的機(jī)體免疫反應(yīng)及損傷；(4) 機(jī)體內(nèi)的預(yù)存抗體使外源編輯酶或效應(yīng)蛋白被中和從而導(dǎo)致基因編輯失敗等。為解決上述問題，亟需建立新型基因編輯工具，特別是擺脫傳統(tǒng)技術(shù)依賴于外源蛋白表達(dá)的桎梏。
ADAR (Adenosine deaminase acting on RNA) 是一類在人體內(nèi)各組織中廣泛表達(dá)的腺苷脫氨酶，能夠催化RNA分子中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）的轉(zhuǎn)換。相比DNA編輯，RNA編輯不需要對基因組序列進(jìn)行永久性改變，這種可逆的、易于調(diào)控的編輯方式在安全性上可能更具優(yōu)勢。麻省理工學(xué)院張鋒課題組曾報(bào)道，過表達(dá)Cas13-ADAR融合蛋白及向?qū)NA可以實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA的精準(zhǔn)編輯 (Science 2017)，但是該方法無法解決外源蛋白表達(dá)造成的問題。魏文勝課題組在研究中首次發(fā)現(xiàn)，只需轉(zhuǎn)入一條特殊設(shè)計(jì)的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能夠通過招募細(xì)胞內(nèi)源的ADAR1 蛋白對靶向基因轉(zhuǎn)錄本上特定的腺苷產(chǎn)生高效精準(zhǔn)的編輯，并不需要引入任何外源效應(yīng)蛋白。ADAR1基因敲除與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和高通量測序分析表明，細(xì)胞內(nèi)源的ADAR1 蛋白介導(dǎo)了這一過程（圖一）。這種新型RNA編輯技術(shù)被命名為LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)。
圖一、 利用細(xì)胞內(nèi)源ADAR1 蛋白實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的RNA編輯。
深入研究表明LEAPER具有廣泛的適用性，能對RNA分子上絕大多數(shù)的腺苷酸位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。在人的原代細(xì)胞-包括肺成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及T細(xì)胞中，LEAPER的編輯效率最高可達(dá)80%，顯示出該技術(shù)在疾病治療中巨大的應(yīng)用前景。在諸多應(yīng)用嘗試中，LEAPER的高效、精準(zhǔn)的特性得到充分驗(yàn)證。比如LEAPER可以通過修復(fù)抑癌基因TP53中的致病突變來恢復(fù)p53突變體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。此外，在Hurler綜合征患者來源的原代細(xì)胞中，LEAPER能夠成功修復(fù)致病突變，并恢復(fù)細(xì)胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性（圖二）。
圖二、 LEAPER修復(fù) p53突變體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能和 α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。
近期的研究表明，DNA單堿基編輯技術(shù)，包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器在RNA或DNA水平上產(chǎn)生了嚴(yán)重的脫靶現(xiàn)象 (Science 2019; Nature 2019)，引發(fā)人們對其安全性的擔(dān)憂。利用RNA-Seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平對LEAPER技術(shù)進(jìn)行的評(píng)估，沒有觀測到明顯的脫靶現(xiàn)象，顯示了新技術(shù)的高度特異性。另外，LEAPER不影響內(nèi)源ADAR蛋白的正常功能，也不會(huì)激活細(xì)胞中的天然免疫反應(yīng)，表明其是一類安全的基因編輯工具。
與RNAi類似，LEAPER充分利用了細(xì)胞中天然存在的機(jī)制：僅用一條RNA 就實(shí)現(xiàn)了精確高效的RNA單堿基編輯，從而避免了任何由于表達(dá)外源效應(yīng)蛋白而引起的各種潛在問題。這種新型的基因編輯技術(shù)在科學(xué)研究和疾病治療中顯示出可觀的優(yōu)勢與潛能，同時(shí)也為發(fā)展基于細(xì)胞內(nèi)源機(jī)制的基因編輯技術(shù)指明了方向。近期，Thorsten Stafforst課題組報(bào)道了命名為RESTORE (recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing) 的RNA編輯方法 (Nature Biotechnology 2019)。與LEAPER類似，RESTORE也能夠利用內(nèi)源ADAR進(jìn)行靶向RNA的精準(zhǔn)編輯；不同之處在于，RESTORE中的向?qū)NA是一段化學(xué)合成的寡核苷酸，為保持其穩(wěn)定性，需要進(jìn)行大量化學(xué)修飾。而LEAPER可以通過穩(wěn)定表達(dá)的方式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此適用于裝載至腺相關(guān)病毒 (AAV)、慢病毒等載體中，在遞送至機(jī)體后持續(xù)發(fā)揮功能。
北京大學(xué)魏文勝課題組博士生璩良 (PTN)、伊宗裔 (CLS)、王春慧 (BIOPIC)、曹中正 (CLS)、博士后朱詩優(yōu)、副研究員周卓博士和博雅輯因生物科技有限公司袁鵬飛博士為該論文共同第一作者，魏文勝為該論文通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)及面上項(xiàng)目、北京市科委生命科學(xué)前沿創(chuàng)新培育項(xiàng)目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心以及傳染病防治國家科技重大專項(xiàng)的基金支持。
文章鏈接: https://www.nature.com/articles/s41587-019-0178-z
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