Plos Biology | 湯富酬課題組與喬杰課題組合作繪制人類視網(wǎng)膜高精度發(fā)育細胞圖譜
人類胚胎發(fā)育從受精卵開始，經(jīng)過著床前胚胎發(fā)育（胚內(nèi)和胚外組織的產(chǎn)生），原腸胚產(chǎn)生（三胚層的特化）和器官發(fā)生等階段，最終新生兒出生。人類胚胎發(fā)育從單個細胞到上萬億個細胞，歷時二百八十天，整個過程的基因表達受到多種因素的精細調(diào)控，其中很多機制尚未明確。
為了解析人類胚胎發(fā)育各個階段的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，自2010年起，北京大學北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學學院湯富酬課題組和北醫(yī)三院喬杰課題組就開始緊密合作，圍繞人類生殖系細胞（包括著床前胚胎細胞和著床后胚胎生殖細胞）發(fā)育的基因表達調(diào)控機制系統(tǒng)地開展研究工作（如圖1所示）。
首先，應(yīng)用湯富酬課題組發(fā)展的單細胞轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)，湯富酬課題組和喬杰課題組繪制了完整的人類生殖系細胞的發(fā)育細胞圖譜，包括著床前胚胎的發(fā)育細胞圖譜（Yan et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2013; Dang et al., Genome Biology, 2016）和著床后胚胎生殖細胞的發(fā)育細胞圖譜（Guo et al., Cell, 2015;Li et al., Cell Stem Cell, 2017），并對其DNA甲基化、染色質(zhì)狀態(tài)等不同層面的表觀遺傳學調(diào)控機制進行了深入的研究（Guo et al., Nature, 2014; Guo et al., Cell Research, 2017; Zhu et al., Nature Genetics, 2018; Li et al., Nature Cell Biology, 2018）。這兩個團隊還與南方醫(yī)科大學趙小陽課題組合作完成了人類成年男性精子發(fā)生過程中的細胞命運轉(zhuǎn)變和基因表達圖譜的繪制（Wang et al.,Cell Stem Cell, 2018）。
圖1湯富酬課題組和喬杰課題組合作項目概覽
此后，兩個團隊全面展開對人類生殖系細胞以及非生殖系的各種重要器官的發(fā)育細胞圖譜的研究，最終目標是繪制出人類胚胎發(fā)育所有重要階段、所有主要器官系統(tǒng)的高精度發(fā)育細胞圖譜。2018年，他們與中科院生物物理所王曉群課題組等合作，繪制了首個來自外胚層的人腦前額葉發(fā)育的單細胞圖譜，揭示了神經(jīng)元分化的成熟機制（Zhong et al., Nature, 2018）。他們還對人類胚胎大腦皮層的所有主要腦區(qū)進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組研究，揭示了大腦皮層的區(qū)域化基因表達和神經(jīng)元成熟的重要特征 （Fan et al., Cell Research, 2018）。上述工作為繪制完整的人腦發(fā)育細胞圖譜奠定了重要的基礎(chǔ)。與此同時，對來自內(nèi)胚層的消化道四種主要器官（食道、胃、小腸和大腸），兩個團隊研究了它們在人類胚胎發(fā)育過程中的基因表達圖譜及其信號調(diào)控機制，進一步解析了從胎兒到成年大腸的發(fā)育、成熟路徑和關(guān)鍵生物學特征 （Gao et al., Nature Cell Biology, 2018）。另外，這兩個團隊還合作開展了對來自中胚層的腎臟和心臟的發(fā)育細胞圖譜研究。對于腎臟，他們深入研究了完整腎單位的細胞分化發(fā)育過程，闡釋了由腎單位前體細胞逐步分化產(chǎn)生不同類型的腎小管上皮細胞過程中對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件和信號通路調(diào)節(jié)機制（Wang et al., Cell Reports, 2018）。對于心臟，他們揭示了心臟發(fā)育過程中關(guān)鍵信號通路的時空特異性激活特征以及心肌細胞與非心肌細胞之間的復雜信號互作機制，為心臟再生的研究提供了重要線索（Cui et al., Cell Reports, 2018）。
2019年7月3日，人類主要器官發(fā)育圖譜又添新作，湯富酬課題組與喬杰課題組在《Plos Biology》雜志上在線發(fā)表了題為“Dissecting the transcriptome landscape of the human fetal neural retina and retinal pigment epithelium by single-cell RNA-seq analysis”（通過單細胞轉(zhuǎn)錄組分析解析人類胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層的轉(zhuǎn)錄組圖譜）的研究成果，對來自外胚層的視網(wǎng)膜進行了深入的發(fā)育細胞圖譜研究。
眼睛是心靈的窗戶，而視網(wǎng)膜可以將外界的光轉(zhuǎn)化為神經(jīng)信號，是眼睛實現(xiàn)感光功能非常重要的組成部分。視網(wǎng)膜內(nèi)層是神經(jīng)層（主要包含視桿細胞、視錐細胞、雙極細胞、無長突細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和繆勒細胞等），外層是色素上皮層（如圖2所示）。目前，已有大量的基于小鼠模型的研究揭示了視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素層的發(fā)育路線。但是，人類視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素層發(fā)育的分子機制以及這兩層結(jié)構(gòu)中的細胞間的相互作用關(guān)系尚未明確。該課題組對來自人類胚胎5周到24周的視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層（RPE）的2400多個細胞進行了高精度單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析。主要發(fā)現(xiàn)有：
圖2人類視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層的示意圖
1. 揭示了人類胚胎視網(wǎng)膜的關(guān)鍵時空發(fā)育特征
該研究對視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層分別取樣，轉(zhuǎn)錄組分析（如圖3所示）顯示神經(jīng)層特異表達神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因，而色素層特異表達的基因與視黃醇代謝相關(guān)。隨著胚胎的發(fā)育，這兩種組織都經(jīng)歷了由早期的細胞增殖高度活躍的狀態(tài)到視覺感知逐漸成熟的狀態(tài)。發(fā)育后期兩者都參與視網(wǎng)膜的視覺感知，暗示了它們在發(fā)育后期可能存在功能上的相互作用。
圖3視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞和色素上皮細胞的轉(zhuǎn)錄組特征
該研究鑒定出了各個類群對應(yīng)的細胞類型（如圖4所示），描繪了各個細胞類型的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并且揭示了體內(nèi)發(fā)育過程中各種主要的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞發(fā)生的準確時間。例如，在人類胚胎發(fā)育的第5周，視神經(jīng)節(jié)細胞已經(jīng)出現(xiàn)，并在第8周時細胞密度達到峰值。在胚胎第7周的時候可以檢測到水平細胞，在胚胎第9周，這種細胞的密度達到峰值。隨后，無長突細胞，光感受器細胞和繆勒細胞等相繼出現(xiàn)。
圖4人類胚胎視網(wǎng)膜的主要細胞類型和細胞發(fā)生時序
2．揭示了參與視網(wǎng)膜發(fā)育的細胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標基因
視網(wǎng)膜發(fā)育研究的一個重要生物學問題是受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的細胞命運決定的機制研究。該研究提供了一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子圖譜。這些轉(zhuǎn)錄因子在視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞和色素上皮細胞中高度活躍，并且它們的靶標基因參與了視網(wǎng)膜發(fā)育的重要事件（如圖5所示）。例如，轉(zhuǎn)錄因子RAX2主要在光感受器細胞中活躍，隨著視網(wǎng)膜的發(fā)育，有一部分RAX2靶標基因的表達上調(diào)，這些基因參與了視覺感知和光刺激的檢測，這與光感受器細胞的功能相符。MITF只在色素上皮細胞中有很高的活性，它的靶標基因在早期參與氨基酸的轉(zhuǎn)運和神經(jīng)管的閉合，晚期參與陽離子的轉(zhuǎn)運。整個發(fā)育過程中，有一部分MITF的靶標基因持續(xù)表達，這些基因參與色素沉淀和細胞動力的調(diào)控。MITF靶標基因參與的上述事件都與視網(wǎng)膜色素上皮細胞的功能吻合。
圖5細胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標基因參與的發(fā)育事件
3．揭示了RPE細胞與光感受器細胞的重要相互作用
該研究提供了RPE細胞與光感受細胞相互作用的諸多線索（如圖6所示）。成體的視網(wǎng)膜中，RPE細胞與光感受器細胞共同參與視循環(huán)-光轉(zhuǎn)導通路。有報道稱光轉(zhuǎn)導始于視紫紅質(zhì)吸收光子。在人類胚胎發(fā)育過程中，直到第24周，光感受器細胞中才第一次檢測到視紫紅質(zhì)基因的表達。然而在視網(wǎng)膜色素細胞中，第13周的時候就可以檢測到一系列與視循環(huán)相關(guān)基因的表達。上述結(jié)果說明，胚胎發(fā)育的第13周，視網(wǎng)膜已經(jīng)開始視循環(huán)，遠遠早于光轉(zhuǎn)導的發(fā)生。該研究還檢測到了成對的受體與配體基因在RPE細胞和光感受器細胞中的表達，這也為研究兩種細胞的相互作用提供了重要線索。
圖6RPE細胞與光感受器細胞的相互作用
4．揭示了視覺相關(guān)疾病潛在靶點基因在發(fā)育過程中的時空特異性表達特征
該研究繪制了胚胎時期視網(wǎng)膜細胞中遺傳疾病相關(guān)基因的表達譜。研究結(jié)果顯示大部分疾病相關(guān)的基因在光感受器細胞，雙極細胞和色素上皮細胞中富集。有報道顯示，在中國人群中，USH2A, EYS和CRB1是導致遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良貢獻最大的三個基因。而在人類胚胎的視網(wǎng)膜中，USH2A主要在光感受器細胞中表達，EYS在雙極細胞和光感受器細胞中高表達，CRB1在繆勒細胞和視網(wǎng)膜前體細胞中富集。視網(wǎng)膜前體細胞是對視網(wǎng)膜形成至關(guān)重要的細胞類群，該研究發(fā)現(xiàn)它還高表達CLRN1, KCNJ13和KIF11等基因，視網(wǎng)膜遺傳性疾病相關(guān)的基因在視網(wǎng)膜前體細胞中的突變可能是研究疾病發(fā)展的重要線索。
總之，該研究繪制了高精度的人類視網(wǎng)膜單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析了細胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標基因參與的發(fā)育事件，探索了視網(wǎng)膜神經(jīng)層與視網(wǎng)膜色素層在發(fā)育時期相互作用的方式，同時該研究還繪制了胚胎時期視網(wǎng)膜細胞的遺傳疾病相關(guān)基因的表達譜。這項成果為人類視網(wǎng)膜發(fā)育的功能性研究和視網(wǎng)膜遺傳性疾病的研究提供了重要線索。
北京大學北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學學院博士后胡玉瓊，北醫(yī)三院王曉曄，北京大學北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學學院博士胡博強、博士生毛雨諾和陳依東為該論文的并列第一作者，湯富酬教授和喬杰教授為該論文的共同通訊作者。該項工作得到了國家重大科學研究計劃、國家自然科學基金委、未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心以及生命科學聯(lián)合中心（CLS）等的支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000365
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