Clinical Epigenetics | 文路副研究員與合作者解析外周血游離DNA組織來源
北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心文路副研究員與首都醫(yī)科大學(xué)世紀(jì)壇醫(yī)院肝膽外科彭吉潤教授合作，利用團(tuán)隊(duì)之前開發(fā)的甲基化CpG短串聯(lián)擴(kuò)增與測序技術(shù)（MCTA-Seq），探究正常人、肝疾患者與急性胰腺炎患者外周血游離DNA的組織來源。研究成果以“Comprehensive DNA methylation analysis of tissue-of-origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing (MCTA-Seq)” 為題在線發(fā)表于6月25日的《臨床表觀遺傳學(xué)》(Clinical Epigenetics)。
近年來，外周血游離DNA因其在無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測與腫瘤液體活檢的臨床應(yīng)用而受到廣泛關(guān)注。正常人外周血中也有一定濃度的游離DNA，主要來源于白細(xì)胞，但有多大比例來自其他組織器官尚不完全清楚。在多種疾病狀態(tài)下，游離DNA濃度會顯著增高，是否來自于受損組織或者另有其它來源，也是一個(gè)尚未解決的問題。DNA甲基化是DNA的主要表觀遺傳修飾。由于不同組織器官具有截然不同的DNA甲基化修飾模式，它非常適合于鑒別游離DNA的組織來源。在之前的研究中，課題組研發(fā)了一種分析外周血游離DNA甲基化組的新技術(shù)MCTA-Seq，在本項(xiàng)研究中，合作團(tuán)隊(duì)將該技術(shù)應(yīng)用于探究外周血游離DNA在生理與病理狀態(tài)下的組織來源問題。
研究者首先采用MCTA-Seq技術(shù)比較了14名正常人的血漿游離DNA與白細(xì)胞基因組DNA，發(fā)現(xiàn)有77個(gè)甲基化位點(diǎn)在血漿游離DNA中被特異檢測到。通過比較八種人體主要組織器官（肝、肺、胃、腸、腎、胰腺、皮膚和肌肉）的MCTA-Seq結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，這77個(gè)血漿vs白細(xì)胞的差異甲基化位點(diǎn)主要是肝臟特異性甲基化位點(diǎn)（圖1）。作為一種互補(bǔ)的方法，他們鑒定了146個(gè)組織特異性甲基化標(biāo)記物，比較血漿與白細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅肝臟特異性甲基化標(biāo)記物在血漿中顯著增高。這些結(jié)果提示，正常人外周血游離DNA，除了白細(xì)胞作為主要來源外，肝臟是另一個(gè)重要來源。為了定量計(jì)算組織來源DNA所占比例，研究者建立了一種粒子群最優(yōu)化算法。結(jié)果表明，正常人血漿游離DNA中肝臟來源比例為1.3%左右(圖2)。
隨后，研究者采用MCTA-Seq結(jié)合粒子群最優(yōu)化算法對13例膽石癥患者、17例肝硬化患者、30例肝癌患者和8例急性胰腺炎患者進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，膽囊結(jié)石患者的游離DNA濃度及組成與正常人接近，而肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的肝臟DNA釋放顯著增加，可高達(dá)30%。肝硬化患者、肝癌患者和急性胰腺炎患者的游離DNA濃度均顯著高于正常人，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致。急性胰腺炎患者外周血中升高的游離DNA過去普遍被認(rèn)為可能來自受損的胰腺組織。然而，研究者通過MCTA-Seq組織來源定量分析意外地發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞才是急性胰腺炎患者外周血中游離DNA升高的主要來源（圖3）。另外，肝硬化患者外周血中升高的游離DNA也主要來源于白細(xì)胞，肝硬化患者的游離DNA升高則是肝臟細(xì)胞與白細(xì)胞共同過度釋放的結(jié)果（圖4）。
正常人外周血游離DNA部分來自肝臟，提示肝臟細(xì)胞存在生理性凋亡和自我更新；肝內(nèi)膽管結(jié)石患者與肝癌患者外周血中有大量肝臟DNA釋放，提示肝臟細(xì)胞在這些病理狀態(tài)下發(fā)生顯著死亡；急性胰腺炎患者升高的游離DNA主要來自白細(xì)胞，可能與免疫系統(tǒng)的急性炎癥激活有關(guān)；肝硬化患者升高的游離DNA主要來自白細(xì)胞，則可能是脾功能亢進(jìn)破壞血細(xì)胞的結(jié)果。
最后，研究者發(fā)現(xiàn)了一類新穎的適用于游離DNA檢測的組織特異性甲基化CpG島。這類CpG島位于組織特異性高表達(dá)基因內(nèi)部,具有很強(qiáng)的組織特異性超甲基化模式（圖5）。
本項(xiàng)研究開發(fā)了組織來源定量分析新算法，揭示了外周血游離DNA在生理與病理狀態(tài)的復(fù)雜組織來源，鑒定了新的組織特異性甲基化標(biāo)記物，拓展了MCTA-Seq應(yīng)用于疾病檢測的前景。
圖1. MCTA-Seq鑒定血漿游離DNA/細(xì)胞差異性甲基化位點(diǎn)
圖2、正常人外周血游離DNA的組織來源。
圖3、急性胰腺炎患者外周血游離DNA的組織來源。
圖4、肝臟疾病患者外周血游離DNA的組織來源。
圖5、位于基因內(nèi)部的肝細(xì)胞特異性超甲基化CpG島。F12為凝血因子XII基因，在肝細(xì)胞中特異性高表達(dá)。綠線顯示甲基化程度，紅色箭頭為MCTA-Seq所檢測的CGCGCGG。
北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院博士生劉曉萌、任杰，北京首都醫(yī)科大學(xué)世紀(jì)壇醫(yī)院肝膽外科博士生羅楠為該論文并列第一作者。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院文路副研究員與北京首都醫(yī)科大學(xué)世紀(jì)壇醫(yī)院肝膽外科彭吉潤教授為該論文的共同通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的基金支持。
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