劉天罡教授利用無細(xì)胞體系挖掘羊毛硫肽類天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)并指導(dǎo)體內(nèi)高產(chǎn) 相關(guān)研究成果發(fā)表于《先進(jìn)科學(xué)》
7月21日，Advanced Science（《先進(jìn)科學(xué)》IF=15.84）以長文Full Paper形式發(fā)表武漢大學(xué)藥學(xué)院劉天罡教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果，論文題為“A Cell-Free Platform Based on Nisin Biosynthesis for Discovering Novel Lanthipeptides and Guiding Their Overproduction In Vivo”（《基于乳酸鏈球菌素生物合成的無細(xì)胞平臺(tái)用于發(fā)現(xiàn)新的羊毛硫肽和指導(dǎo)其體內(nèi)高產(chǎn)》）。
圖1. 無細(xì)胞平臺(tái)用于發(fā)現(xiàn)新的羊毛硫肽和指導(dǎo)其體內(nèi)高產(chǎn)
武漢大學(xué)藥學(xué)院博士生劉然為第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院劉天罡教授為該論文的獨(dú)立通訊作者。該研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金、湖北省杰出青年基金的大力支持。
天然產(chǎn)物中有一類稱之為核糖體合成和翻譯后修飾肽（RiPPs），顧名思義該類化合物是指由核糖體合成的多肽，再經(jīng)過翻譯后修飾而得到的一大類天然產(chǎn)物，而其中又以羊毛硫肽類（Lanthipeptide）化合物最具有代表性，這類化合物具有廣泛的結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性，來源也非常廣泛。比如，乳酸鏈球菌素（nisin），為什么酸菜不會(huì)腐爛？火腿腸如何能夠常溫放置數(shù)月？都是乳酸鏈球菌素超級殺菌的功勞，但是其有能夠被人體分泌的酶分解成氨基酸，其被WHO和FDA批準(zhǔn)作為安全的食物防腐劑已經(jīng)使用了幾十年。
根據(jù)大量的基因組信息暗示，目前已被發(fā)現(xiàn)并鑒定的羊毛硫肽類化合物僅僅占自然界的很小一部分，有大量未知的羊毛硫肽類化合物有待發(fā)現(xiàn)和闡明，但很多含有相關(guān)基因的微生物在實(shí)驗(yàn)室條件中無法培養(yǎng)或者在實(shí)驗(yàn)室條件下無法產(chǎn)生羊毛硫肽。雖然研究人員開發(fā)了大腸桿菌、乳酸菌等異源表達(dá)系統(tǒng)，但這種方式一方面容易形成包涵體，另一方面由于大多數(shù)羊毛硫肽具有抑菌性，因此在異源宿主微生物內(nèi)表達(dá)羊毛硫肽就變成了自相矛盾，想要找到很好的矛（羊毛硫肽），但是它卻刺破了盾（異源宿主微生物）。此外，由于該類化合物具有重要的工業(yè)和醫(yī)用價(jià)值，提升該類化合物的產(chǎn)量有迫切需求，雖然對于其生物合成的酶學(xué)機(jī)理有很好的基礎(chǔ)，但是整個(gè)體系的限速步驟還沒有確定，無法精準(zhǔn)進(jìn)行改造。
基于以上科學(xué)問題，劉天罡教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套無細(xì)胞蛋白合成平臺(tái)（cell-free protein synthesis, CFPS），以其中研究最為透徹的nisin為目標(biāo)化合物。羊毛硫肽的基因簇雖然較為復(fù)雜，但是其中大部分是宿主為了抵抗自身的抑菌活性等而合成的免疫蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及調(diào)節(jié)蛋白，而真正負(fù)責(zé)合成羊毛硫肽的基因只有少數(shù)幾個(gè)。因此，在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中解決目前在羊毛硫肽研究中面臨的種種問題即簡單又高效，矛和盾的問題在無細(xì)胞體系中不存在了！
在這項(xiàng)工作中，首先搭建nisin的CFPS高效合成平臺(tái)，通過在CFPS平臺(tái)利用系統(tǒng)滴定的方式鎖定其生物合成的限速步驟，并以其精準(zhǔn)指導(dǎo)工業(yè)菌株代謝改造，一步改造使nisin產(chǎn)量提升60%；并以此原則指導(dǎo)異源宿主進(jìn)行代謝改造，也使產(chǎn)量提升近90%。其次，利用該平臺(tái)在一天之內(nèi)將NCBI數(shù)據(jù)庫中所有與nisin骨架類似的潛在羊毛硫肽中進(jìn)行了挖掘，從中鑒定到4條具有抑菌活性（包括對耐藥菌MRSA的抑菌活性）的新羊毛硫肽，其中1條對臨床致病菌株糞腸球菌的抑菌活性優(yōu)于nisin。第三，構(gòu)建了nisin的突變體的文庫，利用搭建的CFPS平臺(tái)對其進(jìn)行高通量篩選，最終從中篩選到一條有5個(gè)突變位點(diǎn)的羊毛硫肽M5, 將這種抗革蘭氏陽性菌的化合物賦予了具有抗革蘭氏陰性菌的活性。本研究成果可為高產(chǎn)羊毛硫肽及挖掘新的羊毛硫肽提供一種普適、快速、高效的方法，并且形成的CFPS平臺(tái)也可應(yīng)用于其他RiPPs的研究。
圖2. 羊毛硫肽無細(xì)胞合成平臺(tái)
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202001616
劉天罡課題組鏈接：http://liugroup.whu.edu.cn/
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