PLOS Genetics | 魏麗萍課題組揭示雷特綜合征病人和健康人不同組織中體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子插入突變的特征和頻率
合子后突變是指單一個體自受精卵形成之后，基因組內(nèi)由于DNA復(fù)制錯誤和其他突變源引入的遺傳變異。因此，理論上，同一個體內(nèi)任意兩個細(xì)胞所攜帶的基因組都不相同。反轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子是一種可以在基因組內(nèi)以“復(fù)制—粘貼”的形式跳躍的DNA元件，組成了人類基因組大約30%的序列，是重要的遺傳變異來源。L1Hs是當(dāng)前人類基因組中最活躍的亞家族之一。由于基因組內(nèi)存在大量轉(zhuǎn)座子拷貝，新發(fā)插入事件頻率較低，以及檢測技術(shù)的局限性，國際上對于體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子插入事件的研究多停留在定性和相對定量的層面，個別研究利用單細(xì)胞測序鑒定并解析了少量插入事件。2019年4月11日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點實驗室魏麗萍教授課題組在國際知名學(xué)術(shù)期刊PLOS Genetics上在線發(fā)表了題為“Somatic LINE-1 retrotransposition in cortical neurons and non-brain tissues of Rett patients and healthy individuals”的研究論文，利用新開發(fā)的文庫富集方法和數(shù)據(jù)分析流程，鑒定并研究了雷特綜合征病人和健康人不同組織器官中的體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子插入突變的特征和頻率。
低頻體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子L1Hs插入事件的鑒定、發(fā)生頻率和分布特征
（A）使用大腦前額皮層樣本進行神經(jīng)元特異的流式細(xì)胞分選 （B）L1Hs富集文庫中的核苷酸位移設(shè)計 （C）文庫結(jié)構(gòu)、測序策略以及回帖示意圖 （D）利用HAT-seq鑒定低頻體細(xì)胞L1Hs插入事件示意圖 （E）使用數(shù)字微液滴PCR驗證低頻體細(xì)胞插入事件并定量 （F）對比健康人，雷特綜合征病人的外顯子體細(xì)胞插入顯著減少（G）對比非腦組織，大腦中具有更高的體細(xì)胞插入頻率 （H）對比生殖系插入，體細(xì)胞插入受到較弱的自然選擇壓力
本研究首先建立了從組織DNA中富集轉(zhuǎn)座子插入事件的文庫構(gòu)建方法。利用核苷酸位移設(shè)計，有效提升了擴增子文庫的復(fù)雜性，從而可獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)座子整合位點的序列信息；在下游數(shù)據(jù)分析流程中，同時使用序列特征和信號強度來過濾噪音，并針對回帖錯誤、非特異性擴增進行過濾，以獲得高準(zhǔn)確度。本方法技術(shù)及其應(yīng)用已經(jīng)申請國家發(fā)明專利并公開（申請日2017年5月25日）。本研究在五位雷特綜合征病人和健康人的20個組織樣本中鑒定出9,181個體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子插入事件，其中首次在健康人的非腦組織中鑒定并解析低頻轉(zhuǎn)座子插入。實驗結(jié)果表明，L1Hs可以在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)生轉(zhuǎn)座事件，造成體細(xì)胞嵌合現(xiàn)象。相比于健康人，在雷特病人中有顯著減少的外顯子插入事件，減少主要發(fā)生在長基因(>100 kb)上，暗示已攜帶MECP2突變的細(xì)胞較為脆弱，無法承受額外的外顯子L1Hs插入。大腦相比于非腦組織具有更多的體細(xì)胞L1Hs插入事件，頻率為0.63–1.66/每神經(jīng)元細(xì)胞（健康人）和0.89–1.82/每神經(jīng)元細(xì)胞（雷特病人）。與基因轉(zhuǎn)錄本相同方向的插入（正向）易引起轉(zhuǎn)錄提前終止，因此受到負(fù)選擇。利用同一個體內(nèi)的生殖系插入作為內(nèi)參，本研究發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞插入具有更高的正向插入比例，表明其受到較弱的自然選擇壓力。在一位雷特病人中，本研究鑒定到一個早期胚胎發(fā)育時期發(fā)生的高頻克隆性插入事件，插入到TGM6基因中。該病人與其他四位病人不同，顯示出獨特的TGM6突變相關(guān)的臨床表型，提示存在基因型—表型關(guān)聯(lián)。本研究揭示了體細(xì)胞轉(zhuǎn)座子插入事件的分布特征和頻率，建立的方法平臺將極大促進對低頻體細(xì)胞插入事件的鑒定，對理解體細(xì)胞嵌合突變的產(chǎn)生及其潛在功能有重要意義。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點實驗室魏麗萍教授和2009級博士畢業(yè)生、現(xiàn)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后黃岳博士為論文的共同通訊作者。2012級博士畢業(yè)生、現(xiàn)哈佛醫(yī)學(xué)院博士后趙博洵博士為該論文第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伍啟熹博士，2013級博士畢業(yè)生、現(xiàn)哈佛醫(yī)學(xué)院博士后葉永鑫博士，北京生命科學(xué)研究所郭婧和鄭夏寧，2013級博士畢業(yè)生、現(xiàn)加州大學(xué)圣地亞哥分校博士后楊曉旭博士，2010級博士畢業(yè)生顏林林博士，美國國立衛(wèi)生研究院Qing-Rong Liu博士和美國Lieber研究所Thomas M. Hyde博士為文章共同作者。研究得到了蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點實驗室、北京大學(xué)“臨床醫(yī)院合作專項”、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃、國家自然科學(xué)基金資金支持。
原文鏈接：https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1008043
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