Cell Discovery | 胡家志課題組開(kāi)發(fā)出優(yōu)化基因編輯和追蹤DNA修復(fù)的新方法
2019年3月26號(hào)，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志課題組在Cell Discovery上發(fā)表題為Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing的論文。該研究描述了一種新的方法，可以用來(lái)同時(shí)定量檢測(cè)Cas9編輯效率和脫靶活性以及編輯引起的染色體異常結(jié)構(gòu)，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。這是對(duì)基因編輯和DNA損傷修復(fù)等領(lǐng)域都有巨大促進(jìn)作用的新技術(shù)。
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因編輯工具酶，在科研領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而在臨床方面的應(yīng)用因?yàn)槠涿摪谢钚砸欢韧磺?。它通過(guò)guide RNA（gRNA）與靶向DNA序列的配對(duì)，從而將Cas9錨定在靶向基因并誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）。在基因編輯誘發(fā)的DSB的修復(fù)過(guò)程中，一定幾率會(huì)產(chǎn)生基因突變或者外源DNA片段的插入，從而達(dá)到基因編輯的目的。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，一個(gè)好的基因編輯酶Cas9需要同時(shí)滿足高效切割靶位點(diǎn)、低脫靶活性和低染色體異常三個(gè)特點(diǎn)。目前在這三個(gè)方面，有一部分基于PCR的方法用于估算基因編輯效率，但其結(jié)果可靠性有待提高；有一些基于高通量測(cè)序的方法可以在體內(nèi)或者體外檢測(cè)基因編輯酶的脫靶活性；尚無(wú)系統(tǒng)的可定量的測(cè)量基因組異常結(jié)構(gòu)的方法。
依據(jù)DNA雙鏈斷裂與染色體易位的原理，胡家志課題組在已有的高通量測(cè)序方法(Hu et al., Nature Protocols 2016)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了靈敏度更高且可以全面且定量評(píng)估基因編輯的新方法PEM-seq。與以往基于二代測(cè)序評(píng)估Cas9脫靶活性的方法相比，PEM-seq不僅可以靈敏的找出Cas9的脫靶位點(diǎn)，還可以精確定量CRISPR/Cas9在靶向位點(diǎn)的切割效率，從而找到更加高效安全的Cas9切割位點(diǎn)。與此同時(shí)，PEM-seq還深度揭示了靶向位點(diǎn)附近由于基因編輯而產(chǎn)生的染色體異常結(jié)構(gòu)，例如大片段缺失、染色體易位等。以靶向治療RAG1基因上的RAG1A編輯位點(diǎn)為例，胡家志課題組發(fā)現(xiàn)：在Cas9切割位點(diǎn)5kb以內(nèi)存在著占總編輯事件2.5%的大量的染色體缺失倒位等異常結(jié)構(gòu)；更為嚴(yán)重的是，這些異常結(jié)構(gòu)可以延伸至距離切割位點(diǎn)50kb甚至更長(zhǎng)的領(lǐng)域，足以嚴(yán)重威脅基因組的穩(wěn)定性。這些現(xiàn)象揭示了Cas9應(yīng)用前評(píng)估的必要性。應(yīng)用PEM-seq可以全面地評(píng)估Cas9的切割效率及其所導(dǎo)致的大多異常結(jié)構(gòu)，從而優(yōu)化基因編輯策略，以達(dá)到獲得最大編輯效率且盡量減少脫靶活性的效果。
同時(shí)，為了降低CRISPR/Cas9的脫靶活性，胡家志課題組將現(xiàn)有Cas9變體的突變位點(diǎn)進(jìn)行了組合篩選，通過(guò)PEM-seq篩選出了一個(gè)切割效率與野生型Cas9相當(dāng)?shù)摪蓄l率明顯更低的變體FeCas9。該酶的使用方法與傳統(tǒng)Cas9類似。
此外，PEM-seq在基因組的穩(wěn)定性研究方面還有較大的潛力?；蚪M的修復(fù)與DNA修復(fù)等因素密切相關(guān)，而傳統(tǒng)的方法多用PCR或者分子克隆獲得修復(fù)信息，樣本小且存在偏好性。PEM-seq與一些之前的高通量測(cè)序方法類似，可以提供較大的數(shù)據(jù)量，且相對(duì)而言有一個(gè)更加明顯的優(yōu)勢(shì)，即定量。PEM-seq可以對(duì)DNA修復(fù)的步驟進(jìn)行逐步定量，從而細(xì)致地描畫DNA從損傷到修復(fù)的過(guò)程，以獲得更加精準(zhǔn)的模型。
胡家志課題組的博士生尹健行，博士生劉孟竺和博士后劉陽(yáng)為該文章的第一作者，該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、重大研發(fā)計(jì)劃和生命科學(xué)學(xué)院以及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-019-0088-8
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