[D-Arg25]-Neuropeptide Y (human) ([D-Arg25] NPY) 是 Y1 受體的選擇性激動劑。Neuropeptide Y (human) 和阿爾茲海默癥相關(guān)，能夠保護老鼠皮質(zhì)神經(jīng)元對抗淀粉樣蛋白毒性。
[D-Arg25]-Neuropeptide Y (human) ([D-Arg25] NPY) is a Y1 receptor selective agonist. Neuropeptide Y (human) is involved in Alzheimer's disease (AD) and protects rat cortical neurons against β-Amyloid toxicity[1].

很多蛋白在細胞中非常容易被降解，或被標(biāo)記，進而被選擇性地破壞。但含有部分D型氨基酸的多肽則顯示了很強的抵抗蛋白酶降解能力。

淀粉肽背景：β淀粉樣蛋白（Aβ或Abeta）是從淀粉樣前體蛋白加工而成的含有36–43個氨基酸的多肽。Aβ是與阿爾茲海默病相關(guān)的淀粉樣蛋白斑的成分。已有證據(jù)表明，Aβ是一個多功能肽，具有顯著的非病理性活性。Aβ是阿爾茲海默病患者腦中發(fā)現(xiàn)的沉積物的主要成分。在散發(fā)性阿爾茲海默病患者的腦中，Aβ的水平升高，造成腦血管病變和神經(jīng)毒性。Aβ蛋白是由β和γ分泌酶的連續(xù)作用而產(chǎn)生的。γ分泌酶產(chǎn)生Aβ肽的C末端，在APP的轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域切割，可以產(chǎn)生許多36-43個氨基酸殘基長度的異構(gòu)體，最常見的異構(gòu)體是Aβ40和Aβ42。更長形式的Aβ在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中切割產(chǎn)生，而更短形式的Aβ在反面高爾基網(wǎng)中產(chǎn)生。

structure of Amyloid β-Peptide (1-40) (human)

淀粉樣蛋白肽的 定義淀粉樣蛋白 是絲狀蛋白質(zhì)沉積物，大小從納米到微米不等，并且由肽β鏈的平行或反平行排列形成的聚集的肽β折疊構(gòu)成。

結(jié)構(gòu)特征：使用固態(tài)NMR（SSNMR），與計算能量最小化過程結(jié)合，Tycko和合作者已經(jīng)提出從淀粉狀蛋白肽SS（Aß1-40）的40個殘基的形式形成的淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)構(gòu)在pH 7.4和24 o C在靜止條件下。在這種結(jié)構(gòu)中，每個Aß1-40分子在原纖維的核心區(qū)域貢獻一對ß鏈，大約跨越殘基12-24和30-40。這些由回路25-29連接的鏈不是同一張ß-sheet的一部分，但參與同一原絲內(nèi)兩個不同的ß-sheets的形成。不同的Aß分子2、3至少從第9到39位殘基以平行排列和對齊的方式相互堆疊。通過調(diào)用其他實驗約束，例如使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察到的原絲直徑和單位質(zhì)量通過掃描透射電子顯微鏡（STEM）1、2測得的長度表明，單個原絲是由四個ß片組成的，它們之間的距離約為10Å。

作用模式：阿爾茨海默氏?。ˋD）是淀粉樣蛋白絲狀沉積物的結(jié)果，淀粉狀蛋白沉積物在分子水平上定義該疾病，發(fā)生在神經(jīng)周膜，軸突，樹突和神經(jīng)元末端，如神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT），在細胞外神經(jīng)纖維中淀粉樣斑塊（APC），以及周圍的血管稱為淀粉樣嗜血性血管病（ACA）。淀粉樣蛋白沉積物顯然發(fā)生在發(fā)展NFT的神經(jīng)元末端區(qū)域。已經(jīng)表明，APC和ACA的主要成分已被證明是4.5kDa的淀粉樣蛋白，最初被稱為“β-蛋白”或“淀粉樣蛋白A4”，我們現(xiàn)在將其稱為“βA4”。

功能：鈣失調(diào)和膜破壞是可溶性淀粉樣蛋白低聚物普遍存在的神經(jīng)毒性機制：進行了一項研究，以研究Ca 2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能參與淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細胞毒性，疾病相關(guān)淀粉樣蛋白（β，病毒，胰島淀粉樣蛋白）的均質(zhì)制劑制備了處于各種聚集狀態(tài)的多肽，聚谷氨酰胺和溶菌酶），并測試了它們對加載fluo-3的SH-SY5Y細胞的作用。寡聚形式的所有淀粉樣蛋白的應(yīng)用（0.6-6 µg / ml）迅速（約5 s）使細胞內(nèi)Ca 2+升高，而等量的單體和原纖維則沒有。細胞內(nèi)Ca 2+耗盡后，Abeta42低聚物引起的Ca 2+信號持續(xù)存在店，和小信號仍留在鈣2 + -游離介質(zhì)，指示從細胞外和細胞內(nèi)Ca貢獻2+源。膜對Ca 2+的滲透性增加不能歸因于內(nèi)源性Ca 2+通道的活化，因為反應(yīng)不受強力的Ca 2 +-通道阻滯劑鈷的影響。取而代之的是，觀察到Abeta42和其他低聚物引起陰離子熒光染料的快速細胞泄漏，這表明膜通透性普遍提高。導(dǎo)致的離子和分子通量失調(diào)可能為許多淀粉樣變性疾病中Ca 2+失調(diào)提供了由低聚物介導(dǎo)的毒性的常見機制。離子起著至關(guān)重要的作用，因為它們的跨膜濃度梯度很強，并且參與了細胞功能障礙和死亡。

2型糖尿病中的胰島淀粉樣蛋白和毒性低聚物假說： 2型糖尿?。═2DM）的特征是胰島素抵抗，胰島素分泌缺陷，β細胞量減少，β細胞凋亡增加和胰島淀粉樣蛋白。胰島淀粉樣蛋白源自胰島淀粉樣蛋白多肽（IAPP，胰島淀粉樣多肽），該蛋白是通過胰β細胞與胰島素共表達和共分泌的蛋白。與其他淀粉樣蛋白一樣，IAPP具有形成膜滲透性毒性低聚物的傾向。越來越多的證據(jù)表明，這些有毒的寡聚體而不是這些蛋白質(zhì)的細胞外淀粉樣蛋白形式，是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元丟失的原因。有人提出，胞內(nèi)IAPP寡聚物的形成可能會導(dǎo)致T2DM 6中的β細胞丟失。

定義
神經(jīng)肽的長度為3-40個氨基酸，可作為神經(jīng)遞質(zhì)。它們廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。

發(fā)現(xiàn)
神經(jīng)肽是由約翰·休斯博士和科斯特里茨博士于1975年發(fā)現(xiàn)的。它們是內(nèi)啡肽，內(nèi)在產(chǎn)生的嗎啡樣物質(zhì)，會在體內(nèi)產(chǎn)生一系列類似藥物的作用?？梢詮男蛄行畔?中鑒定神經(jīng)肽前體mRNA序列，并且得到的翻譯蛋白序列包括信號肽序列和一個或多個神經(jīng)肽。廣泛而復(fù)雜的一系列酶處理步驟，包括被激素或前蛋白轉(zhuǎn)化酶切割以及其他翻譯后修飾，在創(chuàng)建活性神經(jīng)肽之前就發(fā)生在翻譯后的蛋白質(zhì)序列上  2,3。

結(jié)構(gòu)特征
通過核磁共振（NMR）光譜研究了幾種來自軟體動物的類似神經(jīng)肽的構(gòu)象性質(zhì)。肽的N末端可變區(qū)中的氨基酸取代對溶液中反向轉(zhuǎn)化的種群具有顯著影響。通過使用兩個獨立的NMR參數(shù)測得的轉(zhuǎn)彎數(shù)，發(fā)現(xiàn)使用Helix aspersa的受體膜制劑與IC50值高度相關(guān)（r2 = 0.93和0.82）。這些結(jié)果表明，構(gòu)象集合降低了特定肽相對于特定受體4,5的有效濃度。

神經(jīng)肽Y與人肽相同，并且與禽胰多肽高度同源。神經(jīng)肽Y和禽胰多肽之間的同源性保留了維持三級結(jié)構(gòu)必不可少的所有殘基。結(jié)果表明，神經(jīng)肽保留了緊湊的三級結(jié)構(gòu)，其特征是在N末端的聚脯氨酸II類螺旋和C末端的a螺旋 6之間廣泛的疏水相互作用。

已經(jīng)通過許多孤兒受體之一發(fā)現(xiàn)了一些肽，這些受體是內(nèi)源性配體未知的受體，例如“類阿片受體樣1”（ORL1）。隨后，已闡明該ORL1受體的內(nèi)源性激動劑的結(jié)構(gòu)，一種稱為孤兒蛋白FQ或傷害感受蛋白的17個氨基酸的肽7。

行動方式
神經(jīng)肽是由神經(jīng)元作為細胞間信使釋放的肽。一些神經(jīng)肽充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)，而另一些充當(dāng)激素。神經(jīng)肽既可以為我們提供支持，也可以為我們提供幫助。抗炎神經(jīng)肽可幫助我們減少皮膚發(fā)炎。神經(jīng)肽是自然產(chǎn)生的，可以在非常有限的時間內(nèi)與靶細胞膜受體在明確的作用位點相互作用。因此，大多數(shù)這些內(nèi)源性化合物的特征在于低的生物屏障滲透性和非常高的酶促降解敏感性。腦室內(nèi)或全身注射神經(jīng)肽Y（NPY）可使cast割的雌性大鼠血漿中的促黃體生成激素（LH）水平降低。6。

功能

生物功能，神經(jīng)肽控制著我們的情緒，能量水平，痛苦和愉悅感，體重以及解決問題的能力；它們還會形成記憶，情感行為，食欲和發(fā)炎，修復(fù)疤痕和皺紋并調(diào)節(jié)我們的免疫系統(tǒng)。這些活躍的大腦小信使實際上打開了皮膚7的細胞功能。因此，今天，與神經(jīng)肽系統(tǒng)相互作用的藥物設(shè)計是后基因組藥物化學(xué)研究最廣泛的途徑之一。

P物質(zhì)已被確定為負責(zé)傷害性信號傳遞的主要神經(jīng)肽。內(nèi)源性阿片類藥物是天然神經(jīng)肽，負責(zé)傷害性信號的調(diào)節(jié)（通常是抑制）。

免疫系統(tǒng)，當(dāng)它們被分泌時，它們會激活自然殺傷細胞（NK細胞），從而增強我們的免疫系統(tǒng)。

隨著內(nèi)啡肽的分泌越來越多，血管病變使收縮的血管恢復(fù)到正常狀態(tài)，使血液以正常方式流動。大多數(shù)成人疾病都始于血管堵塞。內(nèi)啡肽有助于改善血液循環(huán)。

內(nèi)啡肽通過去除超氧化物具有抗衰老作用。從呼吸進入人體的氧氣可以轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸?。這是造成人類疾病和衰老的最大敵人之一。

抗壓力激素，應(yīng)對壓力的能力與我們體內(nèi)的內(nèi)啡肽水平成正比。

緩解疼痛的作用是，我們的神經(jīng)系統(tǒng)在接收到疼痛信號時會分泌神經(jīng)遞質(zhì)。一旦內(nèi)啡肽在疼痛的那一刻被釋放，內(nèi)啡肽就會與神經(jīng)元上的內(nèi)啡肽受體結(jié)合，從而阻止第一種神經(jīng)遞質(zhì)被分泌出來。

記憶力，神經(jīng)肽可以改善記憶力，因為它們可以使腦細胞保持年輕健康。

參考

1.     Hummon AB, Richmond TA, Verleyen P, Baggerman G, Huybrechts J, Ewing MA, Vierstraete E, Rodriguez-Zas SL, Liliane SL, Robinson GE (2006). From the genome to the proteome: uncovering peptides in the Apis brain. Science, 27(314):647-649.

2.     Rockwell NC, Krysan DJ, Komiyama T, Fuller RS (2002). Precursor processing by Kex2/Furin Proteases. Chem. Rev., 102:4525–4548.

3.     Von ER, Beck-Sickinger AG (2004). Biosynthesis of peptide hormones derived from precursor sequences. Curr. Med. Chem.,11:2651–2665.

4.     Edison AS, Espinoza E, Zachariah C (1999). Conformational Ensembles: The Role of Neuropeptide Structures in Receptor Binding. The Journal of Neuroscience., 19(15):6318-6326.

5.     Payza K, Greenberg MJ, Price DA (1989). Further characterization of Helix FMRFamide receptors: kinetics, tissue distribution, and interactions with the endogenous heptapeptides. Peptides, 10:657-661.

6.     Allen J, Novotný J, Martin J, Heinrich G (1987). Molecular structure of mammalian neuropeptide Y: Analysis by molecular cloning and computer-aided comparison with crystal structure of avian homologue. PNAS., 84:2532-2536.

7.     Guya J, Lia S,  Pelletier G (1988). Studies on the physiological role and mechanism of action of neuropeptide Y in the regulation of luteinizing hormone secretion in the rat. Regulatory Peptides., 23(2):209-216.

Kilian Kuhn, et al. Molecular Tools for the NPY Y4 Receptor Derived from the C-Terminus of hPP and from Argininamide-type Y1R Antagonists. zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften an der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Universität Regensburg. : https://epub.uni-regensburg.de/35445/1/KilianKuhn_Dissertation.pdf
Li-Ying Fu, et al. Neuropeptide Y inhibits hypocretin/orexin neurons by multiple presynaptic and postsynaptic mechanisms: tonic depression of the hypothalamic arousal system. J Neurosci. 2004 Oct 6;24(40):8741-51. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15470140
Ambikaipakan Balasubramaniam, et al. Neuropeptide Y (NPY) family of hormones: progress in the development of receptor selective agonists and antagonists. Curr Pharm Des. 2003;9(15):1165-75. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12769744

多肽H2N-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-DArg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2的合成步驟：

1、合成MBHA樹脂：取若干克的MBHA樹脂（如初始取代度為0.5mmol/g）和1倍樹脂摩爾量的Fmoc-Linker-OH加入到反應(yīng)器中，加入DMF，攪拌使氨基酸完全溶解。再加入樹脂2倍量的DIEPA，攪拌混合均勻。再加入樹脂0.95倍量的HBTU，攪拌混合均勻。反應(yīng)3-4小時后，用DMF洗滌3次。用2倍樹脂體積的10%乙酸酐/DMF 進行封端30分鐘。然后再用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，再用甲醇洗滌2次。真空干燥12小時以上，得到干燥的樹脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，測定取代度。這里測得取代度為 0.3mmol/g。結(jié)構(gòu)如下圖：

2、脫Fmoc：取2.33g的上述樹脂，用DCM或DMF溶脹20分鐘。用DMF洗滌2遍。加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取2.1mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入4.19mmol DIPEA，1.99mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

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Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

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Fmoc-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Tyr(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Pro-Gly-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Leu-DArg(Pbf)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Linker-MBHA Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-DArg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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