甲基化修飾多肽
       也叫甲基化標記多肽，甲基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）的一種，幾乎參與細胞所有的生命活動過程，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，蛋白質(zhì)在甲基轉移酶的催化下將甲基轉移至特定的氨基酸殘基上共價結合的過程。甲基化是一種可逆的修飾過程，由去甲基化酶催化去甲基化作用。
       研究發(fā)現(xiàn)，常見甲基化／去甲基化作用的氨基酸主要是賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）研究表明，組蛋白賴氨酸甲基化修飾執(zhí)行著多種生物學功能，如干細胞的維持和分化、Ｘ染色體失活、轉錄調(diào)節(jié)和ＤＮＡ損傷反應等，主要是影響染色質(zhì)濃縮，抑制基因表達。組蛋白精氨酸甲基化在基因轉錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，并能影響細胞的多種生理過程，包括DNA修復、信號轉導、細胞發(fā)育及癌癥發(fā)生等因此專肽生物特地開發(fā)甲基化修飾多肽技術，為科學家在蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMS）的研究中提供幫助。

甲基化修飾(Me1，Me2，Me3)

       采用高品質(zhì)的Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH、 Fmoc-Lys(Me2)-OH、Fmoc-Lys(Me3)-OH.HCL、Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH 、Fmoc-Arg(me)2-OH.HCl(asymmetrical) 、Fmoc-Arg(me)2-OH.HCl(symmetrical) 等原料，采用Fmoc固相合成工藝合成，得到Lys甲基化，Arg甲基化標記的多肽，使用HPLC 對產(chǎn)物進行純化。最終產(chǎn)品提供相應的質(zhì)譜圖，純度分析的HPLC 色譜圖。
 

多肽H2N-Ala-Sar-Ala-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取0.13g CTC Resin（如初始取代度約為0.81mmol/g）和0.13mmol Fmoc-Ala-OH于反應器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入0.32mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應）。得到  Fmoc-Ala-CTC Resin。結構圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Ala-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結構圖如下：

3、縮合：取0.32mmol Fmoc-Sar-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入0.63mmol DIPEA，0.3mmol HBTU。反應30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。得到Fmoc-Sar-Ala-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結構圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Sar-Ala-CTC Resin

Fmoc-Ala-Sar-Ala-CTC Resin

以上中間結構，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結構計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Ala-Sar-Ala-CTC Resin，結構如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Ala-Sar-Ala-COOH。結構圖見產(chǎn)品結構圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復測下純度 是否目標純度。

7、最后總結：

杭州專肽生物技術有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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