IGF-I肽類似物能夠抑制IGF-I對IGF-I受體的自磷酸化以及幾種不同細(xì)胞類型的生長，包括前列腺癌細(xì)胞和SV40轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。

The IGF-I peptide analog was able to inhibit the autophosphorylation of the IGF-I receptor by IGF-I as well as the growth of several different cell types, including prostate carcinoma cells and SV40-transformed cells.

二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。
 

形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。
 

二硫鍵的合成過程，  可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測。  
   

如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡單的。多肽經(jīng)固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進(jìn)行氧化。      
 

當(dāng)需要形成2對或2對以上的二硫鍵時，合成過程則相對復(fù)雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的最后階段完成，但有時引入預(yù)先形成的二硫化物是有利于連合或延長肽鏈的。通常采用的巰基保護(hù)基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團(tuán)。我們分別列出兩種以2-Cl樹脂和Rink樹脂為載體合成的多肽上多對二硫鍵形成路線：
 

二硫鍵反應(yīng)條件選擇    
 

 二硫鍵即為蛋白質(zhì)或多肽分子中兩個不同位點(diǎn)Cys的巰基（-SH）被氧化形成的S-S共價鍵。 一條肽鏈上不同位置的氨基酸之間形成的二硫鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)。多肽分 子通常分子量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)中形成二硫鍵時要求兩個半胱氨酸在空間距離上接近。 此外，多肽結(jié)構(gòu)中還原態(tài)的巰基化學(xué)性質(zhì)活潑，容易發(fā)生其他的副反應(yīng)，而且肽鏈上其他側(cè)鏈 也可能會發(fā)生一系列修飾，因此，肽鏈進(jìn)行修飾所選取的氧化劑和氧化條件是反應(yīng)的關(guān)鍵因素， 反應(yīng)機(jī)理也比較復(fù)雜，既可能是自由基反應(yīng)，也可能是離子反應(yīng)。      

反應(yīng)條件有多種選擇，比如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過程，也可以采用H2O2，I2， 汞鹽等激烈的反應(yīng)條件。
 

空氣氧化法： 空氣氧化法形成二硫鍵是多肽合成中最經(jīng)典的方法，通常是將巰基處于還原態(tài)的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性條件下（PH值6.5-10），反應(yīng)24小時以上。為了降低分子之間二硫鍵形成的可能，該方法通常需要在低濃度條件下進(jìn)行。
 

碘氧化法：將多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘進(jìn)行氧化，反應(yīng)15-40min。當(dāng)肽鏈中含有對碘比較敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時，氧化條件要控制的更精確，氧化完后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉除去過量的碘。 當(dāng)序列中有兩對或多對二硫鍵需要成環(huán)時，通常有兩種情況：
 

自然隨機(jī)成環(huán):       序列中的Cys之間隨機(jī)成環(huán)，與一對二硫鍵成環(huán)條件相似；
 

定點(diǎn)成環(huán)：       定點(diǎn)成環(huán)即序列中的Cys按照設(shè)計(jì)要求形成二硫鍵，反應(yīng)過程相對復(fù)雜。在 固相合成多肽之前，需要提前設(shè)計(jì)幾對二硫鍵形成的順序和方法路線，選擇不同的側(cè)鏈 巰基保護(hù)基，利用其性質(zhì)差異，分步氧化形成兩對或多對二硫鍵。       通常采用的巰基保護(hù) 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團(tuán)。

1.NNZ-2566, a novel analog of (1-3) IGF-1, as a potential therapeutic agent for fragile X syndrome.
Deacon RM1, Glass L, Snape M, Hurley MJ, Altimiras FJ, Biekofsky RR, Cogram P. Neuromolecular Med. 2015 Mar;17(1):71-82. doi: 10.1007/s12017-015-8341-2. Epub 2015 Jan 23.
Fragile X syndrome (FXS) is the most common form of inherited intellectual disability. Previous studies have implicated mGlu5 in the pathogenesis of the disease, and many agents that target the underlying pathophysiology of FXS have focused on mGluR5 modulation. In the present work, a novel pharmacological approach for FXS is investigated. NNZ-2566, a synthetic analog of a naturally occurring neurotrophic peptide derived from insulin-like growth factor-1 (IGF-1), was administered to fmr1 knockout mice correcting learning and memory deficits, abnormal hyperactivity and social interaction, normalizing aberrant dendritic spine density, overactive ERK and Akt signaling, and macroorchidism. Altogether, our results indicate a unique disease-modifying potential for NNZ-2566 in FXS. Most importantly, the present data implicate the IGF-1 molecular pathway in the pathogenesis of FXS. A clinical trial is under way to ascertain whether these findings translate into clinical effects in FXS patients.
2.Potency of Full- Length MGF to Induce Maximal Activation of the IGF-I R Is Similar to Recombinant Human IGF-I at High Equimolar Concentrations.
Janssen JA1, Hofland LJ1, Strasburger CJ2, van den Dungen ES1, Thevis M3. PLoS One. 2016 Mar 18;11(3):e0150453. doi: 10.1371/journal.pone.0150453. eCollection 2016.
AIMS: To compare full-length mechano growth factor (full-length MGF) with human recombinant insulin-like growth factor-I (IGF-I) and human recombinant insulin (HI) in their ability to activate the human IGF-I receptor (IGF-IR), the human insulin receptor (IR-A) and the human insulin receptor-B (IR-B), respectively. In addition, we tested the stimulatory activity of human MGF and its stabilized analog Goldspink-MGF on the IGF-IR.

多肽H2N-Cys-Tyr-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Cys-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.45g CTC Resin（如初始取代度約為0.35mmol/g）和0.61mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入1.52mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Cys(Trt)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Cys(Trt)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取1.52mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入3.04mmol DIPEA，1.45mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ala-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Cys-Tyr-Ala-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Cys-COOH。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

以上所有內(nèi)容，為專肽生物原創(chuàng)內(nèi)容，請勿發(fā)布到其他網(wǎng)站上。