WFYpSPR-pNA, chromogenic substrate for Pin1, an essential and conserved mitotic peptidyl-prolyl isomerase (PPIase), that specifically recognizes the phosphoserine-proline bonds present in mitotic phosphoproteins (kcat/Km = 20160 mM?¹s?¹).

磷酸肽
在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化多肽也有缺點(diǎn)，特別是在合成多磷酸化多肽或氨基酸較長(zhǎng)的多肽的時(shí)候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對(duì)于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。
       后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。
 

目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：

（1）將適當(dāng)保護(hù)的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化。
 

1）將適當(dāng)保護(hù)的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當(dāng)保護(hù)，然后按照正常SPPS 合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點(diǎn)。這種方法操作簡(jiǎn)便，已經(jīng)成為多肽單位點(diǎn) 磷酸化修飾的主要方法。



 

2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化：

        采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進(jìn)行磷酸化修飾時(shí)，磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修 飾的較大基團(tuán)產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會(huì)比較困難， 尤其在含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾時(shí)，合成將變得異常困難，并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜，難 以分離，產(chǎn)率極低。
        因此，當(dāng)肽鏈中多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化時(shí)，可以考慮采用將多肽序列 在樹脂上合成完后，再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化：其合成過程主要 就是在多肽合成結(jié)束之后，選擇性的脫去要標(biāo)記氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可 以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。

        側(cè)鏈保護(hù)基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫 除。采用這種方法時(shí)，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體， 連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷?；瓿煞磻?yīng)。

 Caspase酶對(duì)應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號(hào)（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會(huì)參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長(zhǎng)胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對(duì)P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長(zhǎng)的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

       啟動(dòng)器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：?jiǎn)?dòng)器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動(dòng)器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點(diǎn)，Caspase酶的識(shí)別位

      凋亡啟動(dòng)器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動(dòng)caspase激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對(duì)于形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對(duì)IETD肽序列具有相對(duì)較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動(dòng)級(jí)聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時(shí)，它們?cè)诩?jí)聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因?yàn)樗糯罅藖?lái)自啟動(dòng)器Caspase的信號(hào)，使用對(duì)Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對(duì)活化的Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個(gè)關(guān)鍵成分組成：Caspase識(shí)別序列和信號(hào)產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識(shí)別序列不同，一般由三個(gè)或四個(gè)氨基酸組成（表2）。Caspase酶識(shí)別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強(qiáng)膜的通透性。對(duì)應(yīng)的Caspase識(shí)別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點(diǎn)，釋放產(chǎn)生信號(hào)或抑制信號(hào)的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號(hào)或顏色強(qiáng)度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識(shí)別序列及生色基團(tuán)組成，常見的生色團(tuán)有pNA（對(duì)硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在405 nm處進(jìn)行光密度檢測(cè)。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識(shí)別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動(dòng)態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點(diǎn)法測(cè)定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點(diǎn)結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識(shí)別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

多肽H2N-Trp-Phe-Tyr-Ser(PO3H2)-Pro-Arg-pNA的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.03g CTC Resin（如初始取代度約為0.72mmol/g）和0.89mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時(shí)CTC樹脂體積會(huì)增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入2.22mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時(shí)后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇，封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取2.22mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入4.45mmol DIPEA，2.11mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、N端臨時(shí)Boc保護(hù)：加適當(dāng)DMF到樹脂中，再依次加入8.9mmol DIPEA，4.45mmol Boc酸酐溶液，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。取小樣茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。Boc酸酐：DIPEA：樹脂=6：12：1（摩爾比）。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到 Boc-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)如下：

6、全保護(hù)切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液體積約為樹脂體積的3倍。再次用DCM洗滌樹脂2遍（去除殘留DMF），后將配置好的溶液倒入到反應(yīng)器中，反應(yīng)30分鐘。抽濾樹脂，收集濾液（此時(shí)多肽已經(jīng)從樹脂上分離，存在于濾液中）。多肽序列為 Boc-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-CTC Resin。 在濾液中添加DIEPA，調(diào)PH至7-8。用飽和NaHCO3洗滌濾液，分離出DCM層溶液?？蛇m當(dāng)旋蒸DCM層溶液，減少有機(jī)溶劑。再次加入1或2倍體積的乙酸乙酯，用稀HCl溶液調(diào)PH至微酸性，將多肽從DCM層萃取到乙酸乙酯層。用飽和NaCl洗滌2次乙酸乙酯層。用無(wú)水硫酸鎂吸收乙酸乙酯層的水分。通過減壓旋蒸，直接將乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶體狀固體多肽，用于下一步C端反應(yīng)。或通過減壓旋蒸保留適量乙酸乙酯的溶液體積，加入冰乙醚析出 多肽，然后對(duì)多肽進(jìn)行烘干操作即可用于下一步C端反應(yīng)。Boc-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-COOH的結(jié)構(gòu)圖如下。

7、4-硝基苯胺反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入2.22mmol 4-硝基苯胺到樹脂中，再加入4.45mmol DIPEA、2.11mmol HBTU，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到 Boc-Trp(Boc)-Phe-Tyr(tBu)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Arg(Pbf)-pNA。 結(jié)構(gòu)如下：

8、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過濾掉樹脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Trp-Phe-Tyr-Ser(PO3H2)-Pro-Arg-pNA。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

9、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

10、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

以上所有內(nèi)容，為專肽生物原創(chuàng)內(nèi)容，請(qǐng)勿發(fā)布到其他網(wǎng)站上。