Biotin-TAT (47-57) 是生物素標(biāo)記的 TAT 多肽，是轉(zhuǎn)錄的反式激活因子。Biotin-TAT (47-57) 是最廣泛用于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (PTDs) 的一個(gè)多肽，進(jìn)入不同的原代細(xì)胞是依賴于 ATP 和溫度的，表明參與內(nèi)吞作用。

Biotin-TAT (47-57), a biotin tagged TAT, is a transactivator of transcription. Biotin-TAT (47-57) is one of the most widely used protein transduction domains (PTDs) into different primary cells is ATP- and temperature-dependent, indicating the involvement of endocytosis.

生物素TAT（47-57）是一種生物素化的穿透細(xì)胞的陽(yáng)離子肽，來(lái)源于TAT（反式活化轉(zhuǎn)錄因子）蛋白的N末端，TAT是人類免疫缺陷病毒（HIV）中存在的轉(zhuǎn)錄蛋白的反式激活劑。它具有將肽或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到各種細(xì)胞中的能力。

Biotin-TAT (47-57) is a biotinylated cell penetrating cationic peptide derived from the N-terminus of the TAT (Transactivated-transcripiton) protein, which is a trans-activator of the transcription protein present in the human immunodeficiency virus (HIV). It has the ability to transduce peptides or proteins into various cells.

專肽生物合成用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的生物素化肽。盡管生物素可以在 N 端或 C 端引入（通過(guò)賴氨酸殘基），但我們建議使用 N 端修飾，因?yàn)樗杀镜汀⒊晒β矢?、周轉(zhuǎn)時(shí)間短且易于操作。因?yàn)槎嚯暮铣墒菑?C 端到 N 端合成的，因此，N 端修飾是 SPPS步驟的最后一步，不需要額外的特定縮合步驟。相比之下，C 端修飾需要額外的步驟，并且通常更復(fù)雜。當(dāng)然，原則上生物素可以定位在任何地方。

生物素可以通過(guò)多種不同的接頭或間隔物與肽分離。盡管如此，還是建議包含一個(gè)靈活的間隔物，例如 Ahx（一個(gè) 6 碳接頭），以使生物素標(biāo)簽更加穩(wěn)定或靈活。

專肽生物在 N 端或 C 端提供生物素化：生物素-N 端、賴氨酸-生物素-肽中間和賴氨酸-生物素-C 端。
專肽生物還可以使用 Ahx 接頭或長(zhǎng)碳 (LC) 接頭提供生物素化：生物素-Ahx-N 末端、Lys-Ahx-生物素-肽中間、Lys-Ahx-生物素-C-末端。

（生物素結(jié)構(gòu)）

示例：
GRGDS在N端和C端標(biāo)記生物素的結(jié)構(gòu)展示。

1、GRGDS在N端標(biāo)記生物素，不增加Ahx 接頭

2、GRGDS在N端標(biāo)記生物素，增加一個(gè)Ahx 接頭

3、GRGDS在C端標(biāo)記生物素，不增加Ahx 接頭

4、GRGDS在C端標(biāo)記生物素，增加一個(gè)Ahx 接頭。

細(xì)胞穿膜肽-說(shuō)明
      穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是許多作用靶點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)揮作用的先決條件，然而生物膜的生物屏障作用阻止了許多高分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而很大程度地限制了這些物質(zhì)在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，如何引導(dǎo)這些物質(zhì)穿透細(xì)胞膜是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題，目前介導(dǎo)生物大分子穿透細(xì)胞膜的方法主要包括細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）、脂質(zhì)體、腺病毒、納米顆粒、影細(xì)胞等，而CPPs是一類以非受體依賴方式，非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽，它們的長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸且富含堿性氨基酸，氨基酸序列通常帶正電荷。
      1型人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄激活因子TAT（human immunodeficiency virus-1 transcription activator， HIV-1 TAT）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞穿透肽，它憑借一種無(wú)毒的、高效的方式進(jìn)入細(xì)胞。
      細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）的一個(gè)重要特點(diǎn)是可以攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸（peptide nucleo acid, PNA）、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA、siRNA、200nm的脂質(zhì)體、噬菌體顆粒和超順磁性粒子等，這一性質(zhì)為其成為靶向藥物的良好載體提供了可能。
      CPPs作為載體的優(yōu)勢(shì)在于低毒性和無(wú)細(xì)胞類型的限制，盡管CPPs可輸送不同類型的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，但其實(shí)際應(yīng)用多集中于寡肽、蛋白質(zhì)、寡聚核苷（oligonucleotides，ONs)或類似物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。

跨膜機(jī)理
不同的細(xì)胞穿透肽（CPP）跨膜機(jī)制不同，一個(gè)細(xì)胞穿透肽（CPP）的具體機(jī)制有賴于幾個(gè)參數(shù)，如分子大?。〝y帶物質(zhì)）、溫度、細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)外的穩(wěn)定性等。細(xì)胞穿透肽（CPP）進(jìn)入細(xì)胞的具體機(jī)制目前還不清楚，比較流行的推測(cè)包括以下三種：
A: 倒置膠粒模型（inverted micelle model），CPPs通過(guò)細(xì)胞膜上磷脂分子的移動(dòng)形成倒置膠粒結(jié)構(gòu)，而進(jìn)入胞漿。
B: 直接穿透，即孔隙結(jié)構(gòu)模型 (pore formation model)，CPPs在細(xì)胞膜上組成跨膜的孔隙結(jié)構(gòu)而進(jìn)入胞漿 。
C: 內(nèi)吞方式進(jìn)行細(xì)胞攝取。
來(lái)源: Cell-penetrating peptides and their therapeutic applications, Victoria Sebbage, BioscienceHorizons, Volume 2, Number 1, March 2009.

細(xì)胞穿透肽 HIV TAT
      細(xì)胞穿透肽（如HIV TAT）可以以直接穿透和內(nèi)吞兩種方式進(jìn)入細(xì)胞。HIV TAT或者簡(jiǎn)單的多聚精氨酸可被設(shè)計(jì)作為有效的藥物載體，但CPP（如HIV TAT）是如何實(shí)現(xiàn)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，目前仍不清楚。
簡(jiǎn)單的HIV TAT是如何促進(jìn)象直接穿透和內(nèi)吞作用的入胞機(jī)制的呢？來(lái)自Gerard Wong實(shí)驗(yàn)室的研究人員研究了在不同的條件下，HIV TAT是如何與細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞骨架、特異的胞膜受體相互作用，從而誘導(dǎo)了多重轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。

      有趣的是，TAT在不同條件下可與同一序列發(fā)生多種不同的反應(yīng)，因而與胞膜、細(xì)胞骨架、特異受體相互作用可產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。
      CPP的跨膜機(jī)制與多肽序列存在很敏感的關(guān)系，如果在一個(gè)純親水性的CPP中增加一個(gè)疏水殘基，就能徹底地改變其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，例如，最簡(jiǎn)單的CPP原型-多聚精氨基（polyR），可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜上形成跨膜的孔隙結(jié)構(gòu)。疏水氨基酸通過(guò)插入胞膜來(lái)形成正曲率，精氨酸可同時(shí)形成正曲率和負(fù)曲率，賴氨酸只能沿一個(gè)方向形成負(fù)曲率，這就意味著在精氨酸與賴氨酸/疏水物之間存在補(bǔ)償關(guān)系。
      如果疏水性有助于形成負(fù)高斯曲率（Gaussian curvature），那為什么TAT肽中的疏水含量相對(duì)較低呢？其原因是CPPs都是利用盡可能少的疏水基去形成saddle-splay curvature。序列上的差異很可能只會(huì)在膜上誘導(dǎo)短暫的類似孔隙的跨膜結(jié)構(gòu)，從而形成對(duì)CPP來(lái)說(shuō)更短的孔隙壽命。由于CPP的氨基酸組成不同，TAT肽在有或無(wú)受體情況下都可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用。

     專肽生物提供各類細(xì)胞穿膜肽序列，部分由現(xiàn)貨，例如TAT，R8，R4等，具體可咨詢銷售人員。

Definition

Cell permeable peptides (CPPs) are carriers with small peptide domains that can freely cross cell membranes.  They are mainly used as carriers of proteins and nucleic acids into the cell1.

Discovery

The first CPP was discovered independently by two laboratories in 1988 when it was found that the trans-activating transcriptional activator (Tat) from Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) could be efficiently taken up from the surrounding media by numerous cell types in culture2. 

Structural Characteristics

CPPs typically have an amino acid composition containing either a high relative abundance of positively charged, cationic amino acids such as lysine or arginine, or have sequences that contain an alternating pattern of polar/charged amino acids and non-polar, hydrophobic amino acids3.  Some examples include: TAT peptide-YGRKKRRQRRR, lipid membrane translocating peptide-KKAAAVLLPVLLAAP and Antennapedia leader peptide-KKWKMRRNQFWVKVQRG.

Classification

Numerous CPPs have been identified to date and they belong to a wide variety of protein families. For example, some CPPs are amphipathic protein family members3.

Mode of action

CPPs enter the cell with their carrier by either of three mechanisms:  Direct delivery that involves energy independent entry of the CPPs in to the cell4, endocytosis where the cells take up the CPPs by imbibing them with their cell membranes5 and translocation through the formation of transient structures which is yet to be understood6. 

Functions

CPPs have found numerous applications in medicine as drug delivery agents in the treatment of different diseases including cancer, virus inhibitors, contrast agents for cell labeling a classical example is Green Fluorescent protein GFP, as MRI contrast agents, quantum dots7.  TAT is very effective in delivering drugs in vitro and in vivo and so far a peptide that matches its efficiency has not been found7.

References

1.     Wagstaff KM and David JA (2006). Protein Transduction: Cell Penetrating Peptides and Their Therapeutic Applications, Current Medicinal Chemistry, 13 (12), 1371-1387.

2.     Feng S and Holland EC (1988). HIV-1 Tat trans-activation requires the loop sequence within Tar. Nature 334, 165–167.

3.     Stewart KM, Horton KL, Kelley SO (2008). Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for biology and medicine, Org Biomol Chem., 6(13), 2242-55.

4.     Luo D, Saltzman WM (2000). Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol, 18, 33-37.

5.     Lundberg M., Wikstrom S and Johansson M (2003). Cell surface adherence and endocytosis of protein transduction domains, Mol. Ther., 8, 143–150.

6.     Deshayes S, Gerbal-Chaloin S, Morris MC, Aldrian-Herrada G, Charnet P, Divita G (2004). On the mechanism of non-endosomial peptide-mediated cellular delivery of nucleic acids, Biochim. Biophys. Acta, 1667, 141–147.

7.     Temsamani J and Vida P (2004). The use of cell-penetrating peptides for drug delivery, Drug Discovery Today, 9 (23), 1012-1019.

Chen Sun, et al. Intracellular tracking of single native molecules with electroporation-delivered quantum dots. Anal Chem. 2014 Nov 18;86(22):11403-9. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25341054
Jean Philippe Richard, et al. Cellular uptake of unconjugated TAT peptide involves clathrin-dependent endocytosis and heparan sulfate receptors. J Biol Chem. 2005 Apr 15;280(15):15300-6. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15687490

多肽Biotin-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹(shù)脂：稱取0.79g CTC Resin（如初始取代度約為0.73mmol/g）和0.69mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時(shí)CTC樹(shù)脂體積會(huì)增大好幾倍，避免DCM溶液過(guò)少），再加入1.73mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時(shí)后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇，封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹(shù)脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取1.73mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述樹(shù)脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入3.46mmol DIPEA，1.64mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂。（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹(shù)脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫(huà)出。

最后再經(jīng)過(guò)步驟二得到 H2N-Tyr(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、生物素反應(yīng)連接：在上述樹(shù)脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入1.73mmol 生物素到樹(shù)脂中，再加入3.46mmol DIPEA、1.64mmol HBTU，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Biotin-Tyr(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTCResin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、切割：6倍樹(shù)脂體積的切割液（或每1g樹(shù)脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過(guò)濾掉樹(shù)脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Biotin-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-COOH。結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒(méi)有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過(guò)這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書(shū)肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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