Bz-VGR-pNA, chromogenic substrate for trypsin and for bacterial trypsin-like proteases.

多肽Benzoyl-Val-Gly-Arg-pNA的合成步驟：

1、合成CTC樹(shù)脂：稱取1.96g CTC Resin（如初始取代度約為0.51mmol/g）和1.2mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時(shí)CTC樹(shù)脂體積會(huì)增大好幾倍，避免DCM溶液過(guò)少），再加入3.0mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時(shí)后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇，封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹(shù)脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取3.0mmol Fmoc-Gly-OH 氨基酸，加入到上述樹(shù)脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入6.0mmol DIPEA，2.85mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂。（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹(shù)脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Val-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫(huà)出。

最后再經(jīng)過(guò)步驟二得到 H2N-Val-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、苯甲酸反應(yīng)連接：在上述樹(shù)脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入3.0mmol苯甲酸到樹(shù)脂中，再加入6.0mmol DIPEA，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Benzoyl-Val-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、全保護(hù)切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液體積約為樹(shù)脂體積的3倍。再次用DCM洗滌樹(shù)脂2遍（去除殘留DMF），后將配置好的溶液倒入到反應(yīng)器中，反應(yīng)30分鐘。抽濾樹(shù)脂，收集濾液（此時(shí)多肽已經(jīng)從樹(shù)脂上分離，存在于濾液中）。多肽序列為 Benzoyl-Val-Gly-Arg(Pbf)-CTC Resin。 在濾液中添加DIEPA，調(diào)PH至7-8。用飽和NaHCO3洗滌濾液，分離出DCM層溶液?？蛇m當(dāng)旋蒸DCM層溶液，減少有機(jī)溶劑。再次加入1或2倍體積的乙酸乙酯，用稀HCl溶液調(diào)PH至微酸性，將多肽從DCM層萃取到乙酸乙酯層。用飽和NaCl洗滌2次乙酸乙酯層。用無(wú)水硫酸鎂吸收乙酸乙酯層的水分。通過(guò)減壓旋蒸，直接將乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶體狀固體多肽，用于下一步C端反應(yīng)。或通過(guò)減壓旋蒸保留適量乙酸乙酯的溶液體積，加入冰乙醚析出 多肽，然后對(duì)多肽進(jìn)行烘干操作即可用于下一步C端反應(yīng)。Benzoyl-Val-Gly-Arg(Pbf)-COOH的結(jié)構(gòu)圖如下。

7、4-硝基苯胺反應(yīng)連接：在上述樹(shù)脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入3.0mmol 4-硝基苯胺到樹(shù)脂中，再加入6.0mmol DIPEA、2.85mmol HBTU，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到 Benzoyl-Val-Gly-Arg(Pbf)-pNA。 結(jié)構(gòu)如下：

8、切割：6倍樹(shù)脂體積的切割液（或每1g樹(shù)脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過(guò)濾掉樹(shù)脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Benzoyl-Val-Gly-Arg-pNA。結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒(méi)有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

9、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過(guò)這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

10、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書(shū)肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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