多肽熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標(biāo)記
 

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽 上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標(biāo)記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免?？臻g位阻 被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：
 

定義

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）屬于鋅內(nèi)肽酶家族，統(tǒng)稱為metzincins。metzincin超家族的特征是高度保守的基序，該基序包含在催化位點與鋅結(jié)合的三個組氨酸和位于活性位點下方的保守的蛋氨酸。

發(fā)現(xiàn)

間質(zhì)膠原酶，首先被確定的MMP家族成員，最初是在旨在解釋designed變態(tài)為青蛙1的膠原重塑的實驗中發(fā)現(xiàn)的。MMP家族由20多個共享相同功能域的相關(guān)鋅依賴性酶組成。這些酶既具有通?；趦?yōu)選底物的描述性名稱，又具有基于發(fā)現(xiàn)順序的MMP編號系統(tǒng)1。

結(jié)構(gòu)特征

MMP的基本結(jié)構(gòu)由以下同源結(jié)構(gòu)域組成：1）將MMP引導(dǎo)至分泌或質(zhì)膜插入途徑的信號肽；2）前結(jié)構(gòu)域，通過占據(jù)活性位點鋅使酶具有潛伏期，使底物難以接近催化酶；3）含鋅的催化域；4）溶血毒素域，介導(dǎo)與底物的相互作用并賦予酶特異性；5）連接催化和血紅蛋白結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)。MMP7或基質(zhì)溶素是最小的MMP，缺少血紅素結(jié)構(gòu)域，但在底物降解中表現(xiàn)出特異性。額外的結(jié)構(gòu)域和底物特異性導(dǎo)致MMP分為亞組。

MMP的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中兩個序列基序高度保守。在所有MMP的催化域中發(fā)現(xiàn)的共有基序HExGHxxGxxH，包含3個與活性中心的鋅離子（Zn）配位的組氨酸。PRCGxPD基序位于MMPs前結(jié)構(gòu)域的C末端；該基因座的半胱氨酸殘基（C）與活性中心的鋅原子的配位賦予了酶2、3潛伏期。

行動方式

MMP的體內(nèi)活性在幾個水平上受到嚴格控制。這些酶通常以極低的量表達，其轉(zhuǎn)錄受到細胞因子和生長因子（如白介素（IL-1，IL-4，IL-6），轉(zhuǎn)化生長因子（EGF，HGF，TGFβ）的正向或負向嚴格調(diào)控。 ），或腫瘤壞死因子α（TNFα的）4， 5。這些調(diào)節(jié)分子中的一些可以被MMP蛋白水解激活或失活（反饋作用）。轉(zhuǎn)錄后，MMP活性受到位于新合成的酶的N末端的前肽所賦予的潛伏期的限制。從細胞分泌后，MMPs的激活取決于前結(jié)構(gòu)域與催化位點的相互作用的破壞，這可能通過前結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化或蛋白水解去除而發(fā)生。在其前肽中含有弗林蛋白酶樣識別結(jié)構(gòu)域的MMP（MMP11，MT-MMP，MMP28）可以通過枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族的成員在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中被激活。MMP14在細胞表面的proMMP2激活中起著不可或缺的作用。分泌的MMP的胞外蛋白水解激活可以通過絲氨酸蛋白酶（如纖溶酶）介導(dǎo)，這暗示著這兩個酶基團在ECM重塑中具有相互依賴性。某些活動的MMP可以激活其他proMMP，例如MMP9和MMP1的MMP3激活。激活后，MMP會受到內(nèi)源性抑制劑，自降解和選擇性內(nèi)吞作用的進一步調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）機制內(nèi)吞MMP2、9和137。

功能

MMP參與癌癥的各個方面-MMP誘導(dǎo)的肝素結(jié)合上皮生長因子，胰島素樣生長因子和成纖維細胞生長因子從細胞表面釋放（脫落），促進細胞增殖。另一方面，由MMP釋放和激活ECM螯合的TGFβ可以導(dǎo)致細胞增殖受到抑制。

炎癥性疾病-許多報道暗示MMP1，MMP3和MMP9參與類風(fēng)濕和骨關(guān)節(jié)炎。

心血管疾病-大量研究表明，動脈粥樣硬化和動脈瘤形成部位6的MMP，尤其是MMP9水平升高。已經(jīng)提出MMP代表冠狀動脈疾病患者中炎癥的敏感標(biāo)志。

肺部疾病- MMP的水平升高已經(jīng)牽涉在各種肺部疾病，包括急性呼吸窘迫綜合征，哮喘，支氣管擴張和囊性纖維化的病理生理學(xué)。MMP，EMMPRIN和TIMPs是由肺中的許多常駐細胞產(chǎn)生的，因此使它們在疾病中的作用7的分析變得復(fù)雜。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病-在觀察到MMP9在類似于多發(fā)性硬化癥和格林-巴利綜合癥的動物模型中的關(guān)鍵作用之后，MMPs參與了幾種不同類型的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

休克綜合征- MMP8和MMP9存儲在多形核白細胞的顆粒。這些細胞是炎癥和感染過程中的關(guān)鍵效應(yīng)器。這些MMP在休克中的作用得到了對MMP9缺陷型小鼠的研究的支持，這些小鼠被證明對內(nèi)毒素休克具有抗性。Dubois等人[ 8]提出，特定的MMP9抑制作用是治療敗血性休克綜合癥的一種潛在方法。 

參考

1.     Gross J, Lapiere CM (1962). Collagenolytic activity in amphibian tissues; a tissue culture assay. PNAS., 48:1014-1022.

2.     Nagase H, Woessner F (1999). Matrix metalloproteinases. J Biol Chem., 274(31):21491-21494.

3.     Birkedal-Hansen H. (1995). Proteolytic remodeling of extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol., 7:728-735.

4.     Zucker S, Pei D, Cao J, Lopez-Otin C (2003). Membrane type-matrix metalloproteinases (MT-MMP). Cell Surface Proteases., 54:1-74.

5.     Yang Z, Strickland DK, Bornstein P (2001). Extracellular MMP-2 levels  are regulated by the low-density lipoprotein-related scavenger receptor and thrombospondin. J Biol Chem., 276: 8403-8408.

6.     Van den Steen PE, Dubois B, Nelissen I, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G (2002). Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit Rev Biochem Mol Biol,. 37:376-536.

7.     Haseneen N, Vaday G, Zucker S, Foda HD (2003). Mechanical stretch induces MMP-2 release and activation in lung endothelium: role of EMMPRIN. Am J Physio Lung Cell Mol Physiol., 165:541-547.

8.     Dubois B, Starckx S, Pagenstecher A, Oord J, Arnold B, Opdenakker G. Gelatinase B (2002). Deficiency protects against endotoxin shock. Eur J Immunol., 32:2163-2171.

多肽DABCYL-Gaba-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2的合成步驟：

1、合成MBHA樹脂：取若干克MBHA樹脂（如初始取代度為0.5mmol/g）和1倍樹脂摩爾量的Fmoc-Linker-OH加入到反應(yīng)器中，加入DMF，攪拌使氨基酸完全溶解。再加入樹脂2倍量的DIEPA，攪拌混合均勻。再加入樹脂0.95倍量的HBTU，攪拌混合均勻。反應(yīng)3-4小時后，用DMF洗滌3次。用2倍樹脂體積的10%乙酸酐/DMF 進行封端30分鐘。然后再用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，再用甲醇洗滌2次。真空干燥12小時以上，得到干燥的樹脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，測定取代度。這里測得取代度為 0.3mmol/g。結(jié)構(gòu)如下圖：

2、脫Fmoc：取2.19g的上述樹脂，用DCM或DMF溶脹20分鐘。用DMF洗滌2遍。加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取1.97mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入3.94mmol DIPEA，1.87mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準備）。得到Fmoc-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入1.97mmol 4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)到樹脂中，再加入3.94mmol DIPEA、1.87mmol HBTU，鼓氮氣反應(yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準備）。 得到DABCYL-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHAResin。 結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品DABCYL-Gaba-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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