pp60 (v-SRC) Autophosphorylation Site, Phosphorylate 是 EGFR 底物的磷酸化短肽。通過磷酸化底物定量，pp60 (v-SRC) Autophosphorylation Site, Phosphorylate 可用于 EGFR 激酶抑制劑的篩選。
pp60 (v-SRC) Autophosphorylation Site, Phosphorylated is the phosphorylated peptide of an EGFR substrate. pp60 (v-SRC) Autophosphorylation Site, Phosphorylated can be used for the screening of EGFR Kinase inhibitors via phosphorylated-substrate quantification[1].

磷酸肽
在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化多肽也有缺點，特別是在合成多磷酸化多肽或氨基酸較長的多肽的時候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標記的氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。
       后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；瓿煞磻?yīng)。
 

目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：

（1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化。
 

1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當保護，然后按照正常SPPS 合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點。這種方法操作簡便，已經(jīng)成為多肽單位點 磷酸化修飾的主要方法。



 

2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：

        采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進行磷酸化修飾時，磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修 飾的較大基團產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難， 尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜，難 以分離，產(chǎn)率極低。
        因此，當肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用將多肽序列 在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：其合成過程主要 就是在多肽合成結(jié)束之后，選擇性的脫去要標記氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可 以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)。

        側(cè)鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫 除。采用這種方法時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體， 連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷酰基，完成反應(yīng)。

Liyun Ji, et al. Quantitative mass spectrometry combined with separation and enrichment of phosphopeptides by titania coated magnetic mesoporous silica microspheres for screening of protein kinase inhibitors. 2012 Mar 6;84(5):2284-91. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22304342/

多肽H2N-Arg-Arg-Leu-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr(PO3H2)-Thr-Ala-Arg-Gly-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取0.36g CTC Resin（如初始取代度約為0.37mmol/g）和0.16mmol Fmoc-Gly-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入0.4mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Gly-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Gly-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取0.4mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入0.8mmol DIPEA，0.38mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準備）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(HPO3Bzl)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Gly-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Arg-Arg-Leu-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr(PO3H2)-Thr-Ala-Arg-Gly-COOH。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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