Definition

Caspases are a family of aspartate specific cysteine proteases that play an important role in apoptosis, necrosis and inflammation1.

Discovery

Caspases were first identified in the nematode C. elegans. It was found that the gene ced-3 was required for cell death during C.elegans development2. In 1993, the protein encoded by the ced-3 gene was identified as a cysteine protease and it was found that it had similar properties to the mammalian interleukin-1-beta converting enzyme (ICE) (now known as caspase 1) which at the time was the only known caspase3. Other mammalian caspases were subsequently identified.                                                                          

Classification

There are three types of apoptotic caspases: initiator, effector and inflammatory caspases. Initiator caspases (e.g. CASP2, CASP8, CASP9 and CASP10) cleave inactive pro-forms of effector caspases, thereby activating them4. Effector caspases (e.g. CASP3, CASP6 and CASP7) in turn cleave other protein substrates within the cell, to trigger the apoptotic process4. Inflammatory caspases are involved in immune response (e.g. CASP1, CASP4, CASP5, CASP11, CASP12 and CASP13). Caspase inhibitors regulate the initiation of this cascade4.

Structural Characteristics

Caspases are synthesized as inactive zymogens or procaspases.  Activation of caspases occurs by cleavage of the prodomain in the procaspases5.  The caspase catalytic domain is composed of a twisted, mostly parallel ß-sheet sandwiched between two layers of a-helices. Also they contain an active cysteine residue in their catalytic domain5.  In addition to the catalytic domain, both inflammatory and initiator caspases carry at their N-termini, one or two copies of CARD or DED modules, which are critical for their activation in vivo. These modules are mainly composed of six antiparallel a-helices, with helices a1–a5 building an a-helical Greek key5. The general structure of a caspase inhibitor is [tetrapeptide]-CO-CH2-X, that binds to the Cys285 in the active site of caspases5.

Mode of action

Caspases cleave the substrate after an Asp residue6.  There are several hundred substrates for caspases.  Initially activation of initiator caspases occurs as a result of an extrinsic or intrinsic death signal6.  Activated initiator caspases cleave effector caspases that in turn cleave the substrate at an Asp residue6.  For example, caspase-8 cleaves the pro-apoptotic protein Bid that gets activated and translocates into the mitochondria where it activates other pro-apoptotic proteins, Bax and Bak thus amplifying the death signal6.

Functions

Caspases such as caspase-1 are involved in the activation of pro-inflammatory cytokines such as Interleukin 1 and interleukin 185,6.  Caspases play an important role in apoptosis. One of the hallmark feature of apoptotic cell death is genomic disassembly and proteolysis5,6.   By cleaving their substartes, caspases inactivate cell cycle progression and DNA repair processes.  They also activate several pro-apoptotic proteins5,6.  In some cases Caspases’ role in aberrant processing events has shown their involvement in neurodegenerative disorders such as Huntington disease and Alzheimer’s disease6.  Some of the final targets of caspases include: nuclear lamins, ICAD/DFF45 (inhibitor of caspase activated DNase or DNA fragmentation factor 45), PARP (poly-ADP ribose polymerase) and PAK2 (P 21-activated kinase 2)6.  Caspases are also implicated in embryonic development and T and B cell differentiation7.

References

1.     Book: Cells by Benjamin L, Lynne C, Vishwanath RL, George P (207), 536-540.

2.     Ellis HM, Horvitz HR (1986). Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell, 44(6), 817-29.

3.     Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641–652.

4.        Salvesen GS, Riedl SJ (2008). Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol., 615, 13-23.

5.     Prior PF and Salvesen GS (2004). The protein structures that shape caspase activity, specificity,activation and inhibition. Biochem. J., 384, 201–232.

6.     Nicholson DW (1999). Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death and Differentiation, 6, 1028 ± 1042.

7.     Maelfait J, Beyaert R (2008). Non-apoptotic functions of caspase-8. Biochem Pharmacol., 76(11), 1365-73.

Caspase酶對應的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過程密切相關。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細胞凋亡的主要介質。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調節(jié)該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號（外部或內在）刺激被激活，即會參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導致細胞分解，死亡，吞噬作用和細胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長胱天蛋白酶募集結構域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結構域的“細胞凋亡效應”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長的前提結構域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

       啟動器Caspase和效應器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：啟動器和效應器Caspase酶。啟動器和效應器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點，Caspase酶的識別位

      凋亡啟動器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動caspase激活級聯(lián)反應。Caspase-8對于形成死亡誘導信號復合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應子Caspase（例如Caspase 3）并介導線粒體中細胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負責啟動級聯(lián)途徑，但是當被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關鍵效應器，因為它放大了來自啟動器Caspase的信號，使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進行檢測，可以檢測Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個關鍵成分組成：Caspase識別序列和信號產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同，一般由三個或四個氨基酸組成（表2）。Caspase酶識別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團修飾，以增強膜的通透性。對應的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應切割位點，釋放產(chǎn)生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號或顏色強度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團組成，常見的生色團有pNA（對硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標儀或分光光度計在405 nm處進行光密度檢測。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結構包含與半胱天冬酶識別相關的熒光團，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動態(tài)范圍更窄。 建議將R110標記的Caspase底物用于終點法測定，而將AMC和AFC標記的 Caspase底物用于動力學測定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點結合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結構由Caspase識別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團組成。具有醛官能團的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

多肽H2N-Cys-Arg-Gly-Thr-Glu-Leu-Asp-Cys-Gly-Ile-Glu-Thr-Asp-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.29g CTC Resin（如初始取代度約為0.61mmol/g）和0.94mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反應器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入2.36mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質，有利于后續(xù)反應）。得到  Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。結構圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結構圖如下：

3、縮合：取2.36mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入4.72mmol DIPEA，2.24mmol HBTU。反應30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。得到Fmoc-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結構圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

以上中間結構，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結構計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Gly-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin，結構如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Cys-Arg-Gly-Thr-Glu-Leu-Asp-Cys-Gly-Ile-Glu-Thr-Asp-COOH。結構圖見產(chǎn)品結構圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復測下純度 是否目標純度。

7、最后總結：

杭州專肽生物技術有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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