CSKSSDYQC (Disulfide bridge: C1-C9)(CSK)肽可以特異性識別杯狀細胞，由9個氨基酸的組成的二硫鍵環(huán)肽。

二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。
 

形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。
 

二硫鍵的合成過程，  可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應(yīng)進程進行監(jiān)測。  
   

如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡單的。多肽經(jīng)固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進行氧化。      
 

當需要形成2對或2對以上的二硫鍵時，合成過程則相對復(fù)雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的最后階段完成，但有時引入預(yù)先形成的二硫化物是有利于連合或延長肽鏈的。通常采用的巰基保護基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。我們分別列出兩種以2-Cl樹脂和Rink樹脂為載體合成的多肽上多對二硫鍵形成路線：
 

二硫鍵反應(yīng)條件選擇    
 

 二硫鍵即為蛋白質(zhì)或多肽分子中兩個不同位點Cys的巰基（-SH）被氧化形成的S-S共價鍵。 一條肽鏈上不同位置的氨基酸之間形成的二硫鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)。多肽分 子通常分子量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)中形成二硫鍵時要求兩個半胱氨酸在空間距離上接近。 此外，多肽結(jié)構(gòu)中還原態(tài)的巰基化學性質(zhì)活潑，容易發(fā)生其他的副反應(yīng)，而且肽鏈上其他側(cè)鏈 也可能會發(fā)生一系列修飾，因此，肽鏈進行修飾所選取的氧化劑和氧化條件是反應(yīng)的關(guān)鍵因素， 反應(yīng)機理也比較復(fù)雜，既可能是自由基反應(yīng)，也可能是離子反應(yīng)。      

反應(yīng)條件有多種選擇，比如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過程，也可以采用H2O2，I2， 汞鹽等激烈的反應(yīng)條件。
 

空氣氧化法： 空氣氧化法形成二硫鍵是多肽合成中最經(jīng)典的方法，通常是將巰基處于還原態(tài)的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性條件下（PH值6.5-10），反應(yīng)24小時以上。為了降低分子之間二硫鍵形成的可能，該方法通常需要在低濃度條件下進行。
 

碘氧化法：將多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘進行氧化，反應(yīng)15-40min。當肽鏈中含有對碘比較敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時，氧化條件要控制的更精確，氧化完后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉除去過量的碘。 當序列中有兩對或多對二硫鍵需要成環(huán)時，通常有兩種情況：
 

自然隨機成環(huán):       序列中的Cys之間隨機成環(huán)，與一對二硫鍵成環(huán)條件相似；
 

定點成環(huán)：       定點成環(huán)即序列中的Cys按照設(shè)計要求形成二硫鍵，反應(yīng)過程相對復(fù)雜。在 固相合成多肽之前，需要提前設(shè)計幾對二硫鍵形成的順序和方法路線，選擇不同的側(cè)鏈 巰基保護基，利用其性質(zhì)差異，分步氧化形成兩對或多對二硫鍵。       通常采用的巰基保護 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。

多肽H2N-Cys-Ser-Lys-Ser-Ser-Asp-Tyr-Gln-Cys-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取0.35g CTC Resin（如初始取代度約為0.94mmol/g）和0.39mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入0.99mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Cys(Trt)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Cys(Trt)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取0.99mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入1.97mmol DIPEA，0.94mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準備）。得到Fmoc-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Cys(Trt)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Cys-Ser-Lys-Ser-Ser-Asp-Tyr-Gln-Cys-COOH。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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