740Y-P是PI3K的有效且細胞可滲透的激活劑。

磷酸肽
在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化多肽也有缺點，特別是在合成多磷酸化多肽或氨基酸較長的多肽的時候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對于這種磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標記的氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。
       后磷酸化，采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；瓿煞磻?yīng)。
 

目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：

（1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化。
 

1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當保護，然后按照正常SPPS 合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點。這種方法操作簡便，已經(jīng)成為多肽單位點 磷酸化修飾的主要方法。



 

2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：

        采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進行磷酸化修飾時，磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修 飾的較大基團產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難， 尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜，難 以分離，產(chǎn)率極低。
        因此，當肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用將多肽序列 在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進行磷酸化：其合成過程主要 就是在多肽合成結(jié)束之后，選擇性的脫去要標記氨基酸的側(cè)鏈保護基，對于Tyr，Thr可 以直接使用側(cè)鏈不保護的氨基酸進行反應(yīng)。

        側(cè)鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫 除。采用這種方法時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體， 連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。

多肽H2N-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Ser-Asp-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Met-Asp-Met-Ser-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取0.46g CTC Resin（如初始取代度約為0.44mmol/g）和0.24mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入0.61mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Ser(tBu)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取0.61mmol Fmoc-Met-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入1.21mmol DIPEA，0.58mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準備）。得到Fmoc-Met-Ser(tBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp(Boc)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Met-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gly-Gly-Tyr(HPO3Bzl)-Met-Asp(OtBu)-Met-Ser(tBu)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Ser-Asp-Gly-Gly-Tyr(PO3H2)-Met-Asp-Met-Ser-COOH。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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