專肽生物合成用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的生物素化肽。盡管生物素可以在 N 端或 C 端引入（通過賴氨酸殘基），但我們建議使用 N 端修飾，因?yàn)樗杀镜?、成功率高、周轉(zhuǎn)時(shí)間短且易于操作。因?yàn)槎嚯暮铣墒菑?C 端到 N 端合成的，因此，N 端修飾是 SPPS步驟的最后一步，不需要額外的特定縮合步驟。相比之下，C 端修飾需要額外的步驟，并且通常更復(fù)雜。當(dāng)然，原則上生物素可以定位在任何地方。

生物素可以通過多種不同的接頭或間隔物與肽分離。盡管如此，還是建議包含一個(gè)靈活的間隔物，例如 Ahx（一個(gè) 6 碳接頭），以使生物素標(biāo)簽更加穩(wěn)定或靈活。

專肽生物在 N 端或 C 端提供生物素化：生物素-N 端、賴氨酸-生物素-肽中間和賴氨酸-生物素-C 端。
專肽生物還可以使用 Ahx 接頭或長(zhǎng)碳 (LC) 接頭提供生物素化：生物素-Ahx-N 末端、Lys-Ahx-生物素-肽中間、Lys-Ahx-生物素-C-末端。

（生物素結(jié)構(gòu)）

示例：
GRGDS在N端和C端標(biāo)記生物素的結(jié)構(gòu)展示。

1、GRGDS在N端標(biāo)記生物素，不增加Ahx 接頭

2、GRGDS在N端標(biāo)記生物素，增加一個(gè)Ahx 接頭

3、GRGDS在C端標(biāo)記生物素，不增加Ahx 接頭

4、GRGDS在C端標(biāo)記生物素，增加一個(gè)Ahx 接頭。

多肽Biotin-Ahx-Arg-Gly-Lys-Gly-Asp-Gly-NH2的合成步驟：

1、合成MBHA樹脂：取若干克MBHA樹脂（如初始取代度為0.5mmol/g）和1倍樹脂摩爾量的Fmoc-Linker-OH加入到反應(yīng)器中，加入DMF，攪拌使氨基酸完全溶解。再加入樹脂2倍量的DIEPA，攪拌混合均勻。再加入樹脂0.95倍量的HBTU，攪拌混合均勻。反應(yīng)3-4小時(shí)后，用DMF洗滌3次。用2倍樹脂體積的10%乙酸酐/DMF 進(jìn)行封端30分鐘。然后再用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，再用甲醇洗滌2次。真空干燥12小時(shí)以上，得到干燥的樹脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，測(cè)定取代度。這里測(cè)得取代度為 0.3mmol/g。結(jié)構(gòu)如下圖：

2、脫Fmoc：取1.76g的上述樹脂，用DCM或DMF溶脹20分鐘。用DMF洗滌2遍。加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取1.58mmol Fmoc-Gly-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入3.17mmol DIPEA，1.5mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Gly-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ahx-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Ahx-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHA Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、生物素反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入1.58mmol 生物素到樹脂中，再加入3.17mmol DIPEA、1.5mmol HBTU，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Biotin-Ahx-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Linker-MBHAResin。 結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過濾掉樹脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Biotin-Ahx-Arg-Gly-Lys-Gly-Asp-Gly-NH2。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://amynixphotography.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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