Caspase酶對應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

       啟動器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：啟動器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點(diǎn)，Caspase酶的識別位

      凋亡啟動器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動caspase激活級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對于形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動級聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因?yàn)樗糯罅藖碜詥悠鰿aspase的信號，使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進(jìn)行檢測，可以檢測Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個關(guān)鍵成分組成：Caspase識別序列和信號產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同，一般由三個或四個氨基酸組成（表2）。Caspase酶識別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強(qiáng)膜的通透性。對應(yīng)的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點(diǎn)，釋放產(chǎn)生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號或顏色強(qiáng)度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團(tuán)組成，常見的生色團(tuán)有pNA（對硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計在405 nm處進(jìn)行光密度檢測。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點(diǎn)法測定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動力學(xué)測定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點(diǎn)結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

多肽熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標(biāo)記

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽 上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標(biāo)記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免?？臻g位阻 被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長。可供參考選擇：

Definition

Caspases are a family of aspartate specific cysteine proteases that play an important role in apoptosis, necrosis and inflammation1.

Discovery

Caspases were first identified in the nematode C. elegans. It was found that the gene ced-3 was required for cell death during C.elegans development2. In 1993, the protein encoded by the ced-3 gene was identified as a cysteine protease and it was found that it had similar properties to the mammalian interleukin-1-beta converting enzyme (ICE) (now known as caspase 1) which at the time was the only known caspase3. Other mammalian caspases were subsequently identified.                                                                          

Classification

There are three types of apoptotic caspases: initiator, effector and inflammatory caspases. Initiator caspases (e.g. CASP2, CASP8, CASP9 and CASP10) cleave inactive pro-forms of effector caspases, thereby activating them4. Effector caspases (e.g. CASP3, CASP6 and CASP7) in turn cleave other protein substrates within the cell, to trigger the apoptotic process4. Inflammatory caspases are involved in immune response (e.g. CASP1, CASP4, CASP5, CASP11, CASP12 and CASP13). Caspase inhibitors regulate the initiation of this cascade4.

Structural Characteristics

Caspases are synthesized as inactive zymogens or procaspases.  Activation of caspases occurs by cleavage of the prodomain in the procaspases5.  The caspase catalytic domain is composed of a twisted, mostly parallel ß-sheet sandwiched between two layers of a-helices. Also they contain an active cysteine residue in their catalytic domain5.  In addition to the catalytic domain, both inflammatory and initiator caspases carry at their N-termini, one or two copies of CARD or DED modules, which are critical for their activation in vivo. These modules are mainly composed of six antiparallel a-helices, with helices a1–a5 building an a-helical Greek key5. The general structure of a caspase inhibitor is [tetrapeptide]-CO-CH2-X, that binds to the Cys285 in the active site of caspases5.

Mode of action

Caspases cleave the substrate after an Asp residue6.  There are several hundred substrates for caspases.  Initially activation of initiator caspases occurs as a result of an extrinsic or intrinsic death signal6.  Activated initiator caspases cleave effector caspases that in turn cleave the substrate at an Asp residue6.  For example, caspase-8 cleaves the pro-apoptotic protein Bid that gets activated and translocates into the mitochondria where it activates other pro-apoptotic proteins, Bax and Bak thus amplifying the death signal6.

Functions

Caspases such as caspase-1 are involved in the activation of pro-inflammatory cytokines such as Interleukin 1 and interleukin 185,6.  Caspases play an important role in apoptosis. One of the hallmark feature of apoptotic cell death is genomic disassembly and proteolysis5,6.   By cleaving their substartes, caspases inactivate cell cycle progression and DNA repair processes.  They also activate several pro-apoptotic proteins5,6.  In some cases Caspases’ role in aberrant processing events has shown their involvement in neurodegenerative disorders such as Huntington disease and Alzheimer’s disease6.  Some of the final targets of caspases include: nuclear lamins, ICAD/DFF45 (inhibitor of caspase activated DNase or DNA fragmentation factor 45), PARP (poly-ADP ribose polymerase) and PAK2 (P 21-activated kinase 2)6.  Caspases are also implicated in embryonic development and T and B cell differentiation7.

References

1.     Book: Cells by Benjamin L, Lynne C, Vishwanath RL, George P (207), 536-540.

2.     Ellis HM, Horvitz HR (1986). Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell, 44(6), 817-29.

3.     Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641–652.

4.        Salvesen GS, Riedl SJ (2008). Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol., 615, 13-23.

5.     Prior PF and Salvesen GS (2004). The protein structures that shape caspase activity, specificity,activation and inhibition. Biochem. J., 384, 201–232.

6.     Nicholson DW (1999). Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death and Differentiation, 6, 1028 ± 1042.

7.     Maelfait J, Beyaert R (2008). Non-apoptotic functions of caspase-8. Biochem Pharmacol., 76(11), 1365-73.

Caspase酶對應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

       啟動器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：啟動器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點(diǎn)，Caspase酶的識別位

      凋亡啟動器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動caspase激活級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對于形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動級聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因?yàn)樗糯罅藖碜詥悠鰿aspase的信號，使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進(jìn)行檢測，可以檢測Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個關(guān)鍵成分組成：Caspase識別序列和信號產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同，一般由三個或四個氨基酸組成（表2）。Caspase酶識別序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強(qiáng)膜的通透性。對應(yīng)的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點(diǎn)，釋放產(chǎn)生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號或顏色強(qiáng)度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團(tuán)組成，常見的生色團(tuán)有pNA（對硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計在405 nm處進(jìn)行光密度檢測。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點(diǎn)法測定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動力學(xué)測定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點(diǎn)結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑